1. Первинне розуміння

На цьому етапі нам потрібно зрозуміти деякі поняття та термінологію, щоб уникнути помилок у присутності наших старших, наприклад:

З: Яка різниця між RT-PCR, qPCR, ПЛР у реальному часі та RT-PCR у реальному часі?

Відповідь: RT-PCR – це ПЛР зі зворотною транскрипцією(ПЛР зі зворотною транскрипцією, RT-PCR), яка є широко використовуваним варіантом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).У RT-PCR ланцюг РНК зворотно транскрибується в комплементарну ДНК, яка потім використовується як матриця для ампліфікації ДНК за допомогою ПЛР.
ПЛР у реальному часі та кПЦР(Кількісна ПЛР у реальному часі) – це те саме, обидва є кількісною ПЛР у реальному часі, що означає, що кожен цикл ПЛР має записи даних у реальному часі, тому кількість початкових шаблонів можна регулювати для точного аналізу.

Хоча ПЛР у реальному часі (флуоресцентна кількісна ПЛР у реальному часі) і ПЛР зі зворотною транскрипцією (ПЛР зі зворотною транскрипцією) здається скорочено називаються ОТ-ПЛР, міжнародна конвенція така: ОТ-ПЛР конкретно стосується зворотної транскрипціїПЛР, ПЛР у реальному часі зазвичай скорочується як КПЦР (кількісна ПЛР у реальному часі).

І RT-PCR у реальному часі (RT-qPCR), це ПЛР зі зворотною транскрипцією в поєднанні з флуоресцентною кількісною технологією: спочатку отримайте кДНК (RT) із зворотної транскрипції РНК, а потім використовуйте ПЛР у реальному часі для кількісного аналізу (qPCR).Більшість лабораторій проводять RT-qPCR, тобто дослідження пригнічення експресії РНК, тому qPCR, про який усі говорять у лабораторії, насправді відноситься до RT-qPCR, але не забувайте, що існує ще багато тестів ДНК у клінічних застосуваннях.Кількісний аналіз, наприклад виявлення вірусу гепатиту B HBV.

Запитання: після читання багатьох флуоресцентних кількісних ПЛР, чому ампліфікований фрагмент слід контролювати в діапазоні 80-300 bp?

Відповідь: Довжина кожної генної послідовності різна, деякі становлять кілька килобайт, інші – сотні п.н., але нам потрібно лише вимагати, щоб довжина продукту становила 80-300 п.н., коли розробляємо праймери, надто короткі або надто довгі не підходять для флуоресцентного кількісного виявлення ПЛР.Фрагмент продукту занадто короткий, щоб його можна було відрізнити від праймера-димера.Довжина праймера-димера становить приблизно 30-40 bp, і важко розрізнити, чи це праймер-димер чи продукт, якщо він менше 80 bp.Якщо фрагмент продукту занадто довгий, перевищує 300 bp, це легко призведе до низької ефективності ампліфікації та не зможе ефективно визначити кількість гена.

Наприклад, коли ви підраховуєте, скільки людей у ​​класі, вам потрібно порахувати лише кількість ротів.Те ж саме вірно, коли ви виявляєте гени, вам потрібно лише виявити певну послідовність гена, щоб представити всю послідовність.Якщо хочеш рахувати людей, то треба рахувати і роти, і носи, і вуха, і окуляри, а помилятися легко.

Щоб розширити, у біологічних дослідженнях існує багато випадків дослідження від точки до області, оскільки послідовність гена будь-якого виду дуже довга, немає необхідності та неможливо виміряти всі фрагменти, наприклад бактеріальне секвенування 16S, яке полягає у виконанні консервативної послідовності бактеріальних аналізів для визначення кількості певної популяції бактерій.

З: Яка оптимальна довжина для дизайну праймера кПЛР?

Відповідь: Загалом, довжина праймера становить приблизно 20-24 bp, що краще.Звичайно, ми повинні звернути увагу на значення TM праймера при проектуванні праймера, оскільки це пов'язано з оптимальною температурою відпалу.Після багатьох експериментів було доведено, що 60°C є кращим значенням TM.Якщо температура відпалу занадто низька, це легко призведе до неспецифічного посилення.Якщо температура відпалу занадто висока, ефективність підсилення буде відносно низькою, пік кривої підсилення почнеться пізніше, а значення CT буде затримано.

З: Чим метод фарбування відрізняється від методу зонда?

Відповідь: Метод фарбуванняДеякі флуоресцентні барвники, такі як SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO тощо, самі по собі не випромінюють світло, але випромінюють флуоресценцію після зв’язування з малою борозенкою дволанцюгової ДНК.Тому на початку ПЛР-реакції апарат не може виявити флуоресцентний сигнал.Коли реакція досягає стадії відпалу-подовження, подвійний ланцюг розкривається, і під дією ДНК-полімерази синтезується новий ланцюг, і флуоресцентна молекула зв'язується з малою борозенкою дцДНК.У міру збільшення кількості циклів ПЛР все більше і більше барвників поєднується з дволанцюговою ДНК, і флуоресцентний сигнал також постійно посилюється.Метод барвника в основному використовується в наукових дослідженнях.
PS: Будьте обережні, проводячи експеримент, барвник має поєднуватися з ДНК людини, будьте обережні, щоб перетворити його на флуоресцентну людину.

Метод барвника (ліворуч) Метод зонда (праворуч)
PS: Будьте обережні, проводячи експеримент, барвник має поєднуватися з ДНК людини, будьте обережні, щоб перетворити його на флуоресцентну людину.

SYBR Green Ⅰ зв’язується з малою борозенкою ДНК

Зондовий методЗонд Taqman є найбільш часто використовуваним зондом гідролізу.Існує флуоресцентна група на 5'-кінці зонда, зазвичай FAM, а сам зонд є послідовністю, комплементарною цільовому гену.На 3'-кінці є флуоресцентна група гасіння.Відповідно до принципу резонансної передачі енергії флуоресценції (Förster resonance energy transfer, FRET), коли репортерна флуоресцентна група (донорна флуоресцентна молекула) і гасить флуоресцентна група (акцепторна флуоресцентна молекула) збуджуються. Коли спектри перекриваються і відстань дуже близька (7-10 нм), збудження донорної молекули може індукувати флуоресценцію. молекули акцептора, при цьому автофлуоресценція послаблюється.Тому на початку ПЛР-реакції, коли зонд вільний і неушкоджений у системі, репортерна флуоресцентна група не буде випромінювати флуоресценцію.Під час відпалу праймер і зонд зв'язуються з шаблоном.На стадії подовження полімераза безперервно синтезує нові ланцюги.ДНК-полімераза має 5'-3' екзонуклеазну активність.Дійшовши до зонда, ДНК-полімераза гідролізує зонд із матриці, відокремить репортерну флуоресцентну групу від гасильної флуоресцентної групи та випустить флуоресцентний сигнал.Оскільки між зондом і шаблоном існує взаємозв’язок один-до-одного, метод зонда перевершує метод барвника з точки зору точності та чутливості тесту.В діагностиці в основному використовується зондовий метод.

З: Що таке абсолютна кількісна оцінка?Що таке відносна квантифікація?

Відповідь: Абсолютна кількісна оцінка стосується розрахунку початкової кількості копій зразка, який потрібно перевірити за допомогою КПЦР, наприклад, скільки вірусів ВГВ міститься в 1 мл крові.Результатом, отриманим шляхом відносного кількісного визначення, є зміна кількості цільового гена в конкретному зразку відносно іншого еталонного зразка, і експресія гена регулюється вгору або вниз.

Питання: Чи впливатиме кількість екстракції РНК, ефективність зворотної транскрипції та ефективність ампліфікації на результати експерименту?
З: Чи вплинуть на результати експериментів зберігання зразків, реагенти для екстракції, реагенти для зворотної транскрипції та витратні матеріали, що пропускають світло?
З: Яким методом можна виправити експериментальні дані?

Стосовно цих проблем ми опишемо їх детально в розділах для розширених і розширених нижче.
2. Поглиблені знання

Що стосується флуоресцентної кількісної ПЛР у реальному часі, ми повинні визнати реальність того, що щороку публікуються тисячі наукових досліджень, серед яких технологія флуоресцентної кількісної ПЛР є не малою.

Якщо немає загального стандарту для вимірювання експерименту флуоресцентної кількісної ПЛР, результати можуть сильно відрізнятися.Для того самого гена того самого виду з однаковим методом обробки результати виявлення також будуть сильно відрізнятися, і тим, хто запізнився, буде важко повторити ті самі результати.Ви Ніхто не знає, що правильно, а що ні.

Чи означає це, що флуоресцентна кількісна ПЛР є шахрайською технологією чи ненадійною?Ні, це тому, що флуоресцентна кількісна ПЛР є більш чутливою та точнішою, і трохи неправильна операція дасть абсолютно протилежні результати.Невелика втрата за тисячу миль.Автора статті можуть неодноразово зазнавати тортур рецензенти.У той же час рецензентам журналу також важко вибрати з різних експериментальних результатів.

Загалом, це вказує на відсутність консенсусу в експериментах ПЛР у реальному часі.З цією метою провідні науковці галузі почали формулювати стандарти,вимагати від учасників надавати деякі необхідні експериментальні дані та деталі обробки даних (включаючи необхідні дані) у статті, щоб відповідати цим стандартам.

Рецензенти можуть судити про якість експерименту, прочитавши ці деталі;майбутні читачі також можуть використати це, щоб повторити експеримент або покращити експеримент.Тоді експериментальні результати, отримані таким чином, будуть повними інформації, високої якості та придатними для використання.

MIBBI (мінімальна інформація для біологічних і біомедичних досліджень -http://www.mibbi.org) виникла.MIBBI – це проект, який надає стандарти для експериментів.Видається в натурі.Цей проект спрямований на різноманітні біологічні експерименти, включаючи клітинну біологію, мікрочіпи, кПЦР, які ми зараз обговоримо, тощо, і передбачає кожен тип експерименту під час подання рукописів.Цю інформацію слід надавати завжди.

У проекті MIBBI є дві статті, пов’язані з флуоресцентною кількісною ПЛР, а саме:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – структурована мова та посібник зі звітності для кількісних даних ПЛР у реальному часі;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – мінімум інформації для публікації статей про кількісні ПЛР-експерименти в реальному часі.
Спочатку поговоримо про RDML, специфікацію термінології.

Якщо для всього немає стандартного визначення, неможливо продовжувати дискусію, тому пояснення термінів є таким важливим на іспиті.
Термінологія, яка використовується в експерименті флуоресцентної кількісної ПЛР, включає наступний вміст.QIAGEN зробив для нас найкраще резюме.Далі всі сухітоварів .

Крива посилення
Крива ампліфікації відноситься до кривої, зробленої під час процесу ПЛР, з номером циклу по осі абсцис і інтенсивністю флуоресценції в реальному часі під час реакції по осі ординат.

Відмінна крива підсилення повинна мати такі характеристики: базова лінія плоска або злегка знижена, і немає явного висхідного тренду;точка перегину кривої чітка, а нахил експоненціальної фази пропорційний ефективності підсилення.Чим більше нахил, тим вище ефективність підсилення;загальна крива підсилення Паралельність хороша, що вказує на те, що ефективність підсилення кожної трубки однакова;очевидна експоненціальна фаза кривої ампліфікації зразків низької концентрації.

Базова лінія (Базова лінія)
Базовим є рівень шуму раннього циклузазвичай вимірюється між 3-м і 15-м циклами, оскільки збільшення значення флуоресценції, викликане продуктом ампліфікації, не може бути виявлено протягом цього періоду.Кількість циклів, що використовуються для розрахунку базової лінії, може змінюватись і, можливо, знадобиться зменшити її, якщо використовуються великі кількості матриці або якщо рівень експресії цільового гена є високим.

Встановлення базової лінії вимагає перегляду даних флуоресценції з лінійної кривої посилення.Базову лінію встановлюють так, щоб зростання кривої ампліфікації починалося з номера циклу, більшого, ніж верхнє число базового циклу.Базові рівні потрібно встановлювати окремо для кожної цільової послідовності.Середні значення флуоресценції, виявлені на ранніх циклах, необхідно відняти від значень флуоресценції, отриманих у ампліфікованих продуктах.Останні версії різноманітного програмного забезпечення для ПЛР у реальному часі дозволяють автоматично оптимізувати базові параметри для окремих зразків.

Протягом перших кількох циклів реакції ампліфікації ПЛР сигнал флуоресценції не змінюється.Наближення до прямої лінії називається базовою лінією, але якщо ми уважно подивимося на перші кілька циклів, то побачимо, що в межах базової лінії відбувається те, що відбувається на малюнку нижче.

Фон Фон відноситься до
значення неспецифічної флуоресценції в реакції.Наприклад: неефективне гасіння флуоресценції;або велика кількість дволанцюгових матриць ДНК завдяки використанню SYBR Green.Фонові компоненти сигналу видаляються математично за допомогою програмного алгоритму ПЛР у реальному часі.

Репортерський сигнал
Репортерний сигнал відноситься до флуоресцентного сигналу, створеного SYBR Green або флуоресцентно міченими зондами, специфічними для послідовності, під час ПЛР у реальному часі.

Нормалізований репортерний сигнал (RN)
RN означає інтенсивність флуоресценції репортерного барвника, поділену на інтенсивність флуоресценції пасивного еталонного барвника, виміряну в кожному циклі.

Пасивний еталонний барвник
У деяких ПЛР у реальному часіфлуоресцентний барвник ROX використовується як внутрішній еталон для нормалізації флуоресцентного сигналу.Він коригує зміни через неточне піпетування, положення лунки та коливання флуоресценції на основі кожної лунки.

Поріг флуоресценції (поріг)
було скориговано вище фонового значення та значно нижче значення плато кривої посилення.Він повинен лежати в лінійній області кривої ампліфікації, що представляє логарифмічний лінійний діапазон детекції ПЛР.Порогові значення мають бути встановлені на кривій логарифмічної ампліфікації, щоб можна було легко ідентифікувати логарифмічну лінійну фазу ПЛР.Якщо в ПЛР у реальному часі є кілька цільових генів, порогове значення має бути встановлено для кожної мішені.Як правило, сигнал флуоресценції перших 15 циклів реакції ПЛР використовується як фоновий сигнал флуоресценції, а поріг флуоресценції в 10 разів перевищує стандартне відхилення сигналу флуоресценції перших 3–15 циклів ПЛР, а поріг флуоресценції встановлюється в експоненціальній фазі ампліфікації ПЛР.Загалом, кожен інструмент має свій поріг флуоресценції, встановлений перед використанням.

Поріг циклу (CT) або точка перетину (CP)
Цикл, за якого крива ампліфікації перетинає поріг (тобто точка, за якої виявлення флуоресценції значно збільшується).CT може бути дробом і можна обчислити кількість початкового шаблону.Значення CT представляє кількість циклів, коли флуоресцентний сигнал у кожній пробірці для реакції ПЛР досягає встановленого порогу.Існує лінійна залежність між значенням CT кожного шаблону та логарифмом початкового номера копії шаблону,чим вище початкова кількість копій, тим менше значення CT, і навпаки.Стандартну криву можна створити за допомогою стандарту з відомим початковим номером копії, де абсциса представляє значення CT, а ордината представляє логарифм початкового номера копії.Отже, поки отримано значення CT невідомого зразка, початкову кількість копій зразка можна розрахувати за стандартною кривою.

значення ΔCT
ΔCT значення описуєрізниця між цільовим геном і відповідним значенням CT ендогенного еталонного гена, як-от ген господарювання, і використовується для нормалізації кількості використовуваного шаблону:
⇒ΔCT = CT (цільовий ген) – CT (ендогенний еталонний ген)

ΔΔCT Значення
Значення ΔΔCT описує різницю між середнім значенням ΔΔCT досліджуваного зразка (наприклад, стимульованих клітин) і середнім значенням ΔΔCT контрольного зразка (наприклад, нестимульованих клітин).Еталонний зразок також називається калібрувальним зразком, і всі інші зразки нормалізуються до нього для відносної кількісної оцінки:
⇒ΔΔCT = середнє ΔCT (зразок, який цікавить) – середній ΔCT (еталонний зразок)

Ендогенні референтні гени (ендогенні еталонні гени)
Рівні експресії ендогенних еталонних генів, таких як гени домашнього господарства (гени домашнього господарства), не відрізняються між зразками.Порівняння значень CT референтного гена з цільовим геном дозволяє нормалізувати рівень експресії цільового гена до кількості введеної РНК або кДНК (див. розділ про значення ΔCT вище).

Внутрішні еталонні гени коректні дляможлива деградація РНК або наявність інгібіторів ферментів у зразках РНК, а також варіації вмісту РНК, ефективності зворотної транскрипції, відновлення нуклеїнової кислоти та обробки зразків.Щоб вибрати оптимальний еталонний ген(и), ми модифікували алгоритм, щоб дозволити вибір оптимального еталонного гена в залежності від експериментальних налаштувань.

Внутрішній контроль
Контрольна послідовність, яка ампліфікується в тій самій реакції, що й цільова послідовність, і досліджується іншим зондом (тобто виконується дуплексна ПЛР).Внутрішні засоби контролю часто використовуються для виключення невдалих ампліфікацій, наприклад, коли цільова послідовність не виявлена.
Зразок калібрування
Еталонний зразок (наприклад, очищена РНК із клітинної лінії або тканини), який використовується для відносного кількісного визначення для порівняння всіх інших зразків для визначення відносного рівня експресії гена.Калібрувальний зразок може бути будь-яким зразком, але зазвичай є контролем (наприклад, необроблений зразок або зразок із нульового часу експерименту).

Позитивний контроль
використовувати контрольні реакції свідомі кількості шаблону.Позитивні контролі часто використовуються для перевірки правильності роботи набору праймерів або набору праймер-зонд і правильності налаштування реакції.

Без контролю шаблонів (NTC)
Контрольна реакція, яка містить усі необхідні компоненти реакції ампліфікації, крім матриці, яку зазвичай замінюють водою.Використання NTC може виявити забруднення, викликане забрудненням реагентом або чужорідною ДНК, таким чином забезпечуючи автентичність і надійність даних виявлення.Посилення контролю NTC вказує на забруднення.

Без контролю RT (NRT)
Процес екстракції РНК може містити залишки геномної ДНК, яка є надзвичайно шкідливою та є причиною впливу на якість даних і є природним ворогом кПЦР, тому під час планування експериментів його потрібно розробляти лише для посилення виявлення РНК.Є два способи: один — сконструювати праймери через інтрони, інший — повністю видалити ДНК, який із них кращий, про що ми поговоримо пізніше.Контроль NTR є чарівним дзеркалом для виявлення забруднення ДНК.Якщо є посилення, це означає, що є забруднення.

Стандарти
Стандарти — це зразки з відомою концентрацією або кількістю копій, які використовуються для побудови стандартної кривої.Щоб забезпечити стабільність стандарту, фрагмент гена зазвичай клонують у плазміду та використовують як стандарт.

Стандартна крива
зазвичай розбавляють принаймні 5 градієнтами концентрації стандартним продуктом відповідно до коефіцієнта подвоєння, і 5 точок малюють у координатах значення CT і кількості копій, і точки з’єднують, щоб утворити лінію для створення стандартної кривої.Для кожної стандартної кривої необхідно перевірити її достовірність.Значення нахилу коливається від –3,3 до –3,8, і кожну концентрацію виконують у трьох повторах.Точки, які суттєво відрізняються від інших точок, слід викинути.Значення CT зразка, що підлягає тестуванню, вноситься до стандартної кривої, і можна розрахувати рівень експресії зразка, що підлягає тестуванню.

Значення CT зразка, який потрібно перевірити, вноситься до стандартної кривої, і можна розрахувати початкову кількість копій зразка, який потрібно перевірити.

Ефективність і нахил
Нахил стандартної кривої відображає ефективність ПЛР у реальному часі.
· Нахил -3,322 вказує на те, що ефективність ПЛР-ампліфікації дорівнює 1 або 100% ефективності, а кількість продукту ПЛР подвоюється в кожному циклі.
· Нахил менше ніж –3,322 (наприклад, –3,8) вказує на ефективність ПЛР
·Нахил, що перевищує –3,322 (наприклад, –3,0), вказує на те, що ефективність ПЛР виявляється більшою за 100%, що цікаво, як один цикл ПЛР може генерувати більш ніж подвоєний продукт ампліфікації?Така ситуація виникає в нелінійній фазі ПЛР-реакції, тобто спостерігається велика кількість неспецифічної ампліфікації.

крива плавлення
Після завершення ампліфікації ПЛР продукт ПЛР нагрівають.У міру підвищення температури дволанцюговий продукт ампліфікації поступово плавиться, що призводить до зменшення інтенсивності флуоресценції.При досягненні певної температури (Tm) велика кількість продуктів розплавиться.Флуоресценція різко падає.Різні продукти ПЛР мають різні значення Tm і різні температури плавлення, щоб можна було визначити специфічність ПЛР.

Крива плавлення (похідна крива)
Крива плавлення виводиться для формування карти піків, яка може більш інтуїтивно відображати ситуацію з фрагментами продукту ПЛР.Оскільки температура плавлення є значенням Tm фрагмента ДНК, можна оцінити деякі параметри, які впливають на значення Tm фрагмента ДНК, наприклад розмір фрагмента, вміст GC тощо. Загалом, згідно з нашими принципами розробки праймерів,довжина ампліфікованого продукту знаходиться в діапазоні 80-300 bp, тому температура плавлення повинна бути між 80°C і 90°C.

Інтерпретація кривої плавлення: Якщо єдиний основний пік з’являється між 80°C-90°C, це означає, що флуоресцентна кількісна ПЛР ідеальна;якщо основний пік з’являється між 80°C-90°C, а інший пік з’являється знову, коли температура підвищується, в основному вважається, що є забруднення ДНК, і ДНК потрібно видалити на початковому етапі експерименту.

Звичайно, є ще деякі нестандартні ситуації, які будуть розібрані по черзі нижче.
3. Поглиблені знання

Щоб зробити КПЦР, я повинен сказати MIQE,Мінімум інформаціїдля публікаціїКількіснийПЛР в реальному часіЕксперименти — мінімум інформації для публікації статей про кількісну ПЛР в реальному часіЩоб спростити розуміння всім, ми спростимо ключовий контент.

Ви можете пошукати оригінальний текст MIQE в Інтернеті, і найголовніше, що він передбачаєконтрольний список даних, які необхідно надати при публікації статті .

Що це означає?E: важлива інформація (потрібно надати);

MIQE (1) — Експериментальний дизайн
Багато покидьків, які захистилися після закінчення аспірантури, не знатимуть, як самостійно спланувати експеримент, відкрити зошит і робити те, що їм каже вчитель.У результаті експериментальний дизайн не був суворим, і редакційний відділ журналу сказав, що вони хотіли вигадати цю фотографію і ту картину, тому вони зробили це в заціпенінні.Ось так робляться покидьки!

суворість експериментальної логіки.Найфундаментальнішим є дизайн експерименту, і найважливішим у плані експерименту є те, як встановити цільовий зразок, еталонний зразок (контроль) і кількість повторів, щоб експериментальні дані могли бути посиланнями, порівнянними та переконливими.

відноситься до зразка, який вимагає від нас виявлення цільового гена після певної обробки.це зразок без будь-якої обробки, який часто називають диким типом у біології.

дуже важливі.

Ми хочемо обприскати пестицидами три рослини ABC, тоді три рослини ABC є трьома біологічними копіями, і це той самий перевірочний експеримент, проведений з різними матеріалами.Але в якості експерименту безперечно потрібен контроль, тому ми можемо обприскати одну з гілок рослини А, щоб сформувати експериментальну групу рослини А, і не обприскувати інші гілки рослини А, щоб сформувати контрольну групу.

Технічні репліки (технічні репліки)

Знову візьмемо як приклад перець, оброблений пестицидами.Для експериментальної групи рослини A ми зробили три ПЛР-лунки 1, 2 і 3 для цільового гена та внутрішнього еталонного гена відповідно, щоб отримати середнє значення після виявлення.Для боротьби з рослинами групи А також обробляються таким же чином.Подібним чином виконайте таку ж обробку рослин B і C.Це технічне повторення.

те, що входить у статистику, — це біологічне повторення, а технічне повторення — перевірити, чи є якісь випадкові явища в експериментальному процесі, щоб зробити експериментальні результати достовірними, тобто уникнути помилок, беручи середнє значення, як ми часто говоримо.

Негативні контролі — NTC і NRT
NTC (контроль без шаблонів)Зазвичай вода використовується як шаблон.

Ці забруднення походять від: нечистої води, некваліфікованих реагентів, що містять ендогенну ДНК, забруднення праймерів, забруднення лабораторного обладнання, аерозольного забруднення тощо, необхідно використовувати поглиначі РНКази та інгібітори РНКази.Найважче виявити аерозольні забруднення.Уявіть, що ваша лабораторія схожа на смог із різними нуклеїновими кислотами, завислими в повітрі.

НЗТ (без зворотної транскриптази), контроль без зворотної транскрипції, є РНК без зворотної транскрипції як негативний контроль, який є контролем залишку гДНК.

Під час експресії генів кількість РНК визначається шляхом визначення кількості кДНК після зворотної транскрипції.Якщо під час очищення РНК є залишок гДНК, це спричинить помилки в експериментальних результатах, оскільки фактично отримані результати є гДНК та кДНК.На сукупному рівні, а не лише кДНК, гДНК потрібно повністю видалити під час екстракції РНК.

MIQE (2) — зразок інформації
Так званий зразок інформації означає, що коли ми публікуємо статтю про КПЦР, ми повинні чітко пояснити зразок інформації, який є невід’ємною частиною статті.Так само, коли ми обробляємо зразки, ми також повинні регулювати наші власні операції, щоб забезпечити валідність зразків.

Опис зразка є лише результатом, і ми повинні звернути більше уваги на матеріали, взяті протягом усього експерименту.

Відбір експериментальних матеріалів
Зразки крові – відбирають свіжу кров, не більше 4 годин.Зразки клітин – виберіть для збору свіжі клітини в період інтенсивного росту.Тканина тваринного походження — вибирайте свіжу тканину, що інтенсивно зростає.Рослинна тканина – вибирайте свіжу, молоду тканину.

Ви, мабуть, помітили, що в цих кількох реченнях є ключове слово: свіжий .
Для наведених вище зразків найкращим, економічно ефективним і стабільним набором на ринку є набір Foregene, який може швидко й легко витягти їх ДНК і РНК.

Міні-набір ДНК крові

Набір для виділення тотальної РНК клітини

Набір для виділення тотальної РНК тварин

Набір для виділення тотальної РНК рослин

Набір для виділення загальної РНК рослин Plus

Набір для виділення ДНК рослин

Зберігання експериментальних матеріалів
Однак є багато друзів, які не можуть проводити експерименти відразу після відбору проб, а деяким навіть потрібно нести баки з рідким азотом у поле для відбору проб.

Для експериментів з РНК необхідно дотримуватися принципу шести слів:низька температура, відсутність ферментів,ішвидко .

без ферментів РНКаза є скрізь у світі, в якому ми живемо (інакше вас би вбив ВІЛ), тому те, як уникнути РНКази під час експериментів є дуже важливою концепцією;швидко,.

ЧомуForegene

PS: Деякі дівчата дуже обережно проводять експерименти, але вони не такі хороші, як слем-данк після кількох років роботи.Вони вважають, що Бог несправедливий, скаржаться на інших і шукають життя.Насправді вона цього не розуміла.Він погано захищав РНК, і гравець у слем-данк був спритним.Коли він проводив експеримент, він думав, що закінчить слем-данк трьома, п’ятьма разами та двома поділками, але він добре виконав експеримент.

Примітка: Повільніше, більше шансів на вторгнення РНКази.Як привчити себе бути швидким?Немає способу, просто практикуйтеся більше.

Для процесу збирання та зберігання зразків MIQE вимагає, щоб це було чітко написано в папері, щоб рецензенти могли перевірити надійність паперу, а також було зручно для приголомшеної молоді повторити ваш експеримент.

Якщо ви не будете обережні, ви можете перевернути світ.Наприклад, перетворити SARS на біохімічну кризу або створити гібридний рис, щоб врятувати 1,3 мільярда людей.На зображенні нижче зображений хімічний експеримент. Ви повинні зрозуміти, наскільки ви пишаєтеся своїми дослідженнями, просто подивившись на його зовнішність, схожу на члена.Забудь, не чорни його.

MIQE (3) – екстракція нуклеїнової кислоти.

Дивлячись на цю форму, не втримаєшся на поверхні.Форма - це догма.Щоб бути кращим студентом, ви повинні запитати, чому.Основним змістом цієї таблиці є: Переслідування .

Перша частина впроцес або інструмент є етапом екстракції нуклеїнової кислоти.Якщо ви використовуєте для екстракції автоматичний екстрактор нуклеїнових кислот (додатково, будь ласка, зв’яжіться зі мною для покупки), вам потрібно вказати назву моделі приладу.

Назва комплекту і

який набір використовувався для деталі зміни, які спеціальні реагенти були додані або які спеціальні операції були виконані, слід чітко пояснити, щоб інші могли легко повторити ваш експеримент.

Деякі люди додають якісь спеціальні реактиви при вилученні спеціальних зразків, думаючи, що це їх секретна зброя, і не кажуть іншим.Зберігаючи це в таємниці, вони також втрачають можливість зробити вашу статтю яскравою.Не будь розумним, ти повинен бути чеснішим, ніж сільський старий Чжан у наукових дослідженнях, якщо ти хочеш бути розумним, стаття зробить тебе дурним.

необхідно запам'ятати номер товару в наборіколи ви замовляєте набір і пишете статтю.Як правило, на наборі є два номери: Cat — каталожний номер (номер продукту, артикул), Lot — номер партії продукту (використовується для вказівки, з якої партії надійшов продукт).

Крім того, номер CAS часто використовують при замовленні біохімічних реактивів, і я його разом популяризуватиму.Номер CAS — це номер, який присвоює Американське хімічне товариство кожному новому хімічному препарату.Як правило, три числа з’єднуються тире.Номер CAS Рушуї: 7732-18-5.Хімікати часто мають кілька псевдонімів, але номер CAS є унікальним.Замовляючи ліки, ви можете спочатку перевірити його номер CAS.

Ближче до дому, чому ми повинні чітко описувати ці речі?Насправді це ще й перевірка якості екстракції РНК.Використання інструментів і наборів зробить виділення РНК більш послідовним.Масштаб вилучення в звичайних лабораторіях не великий, і його можна отримати за допомогою наборів.

Подробиці лікування ДНКазою або РНКазою
Важливим питанням флуоресцентної кількісної ПЛР є запобігання забрудненню ДНК і не експериментуйте, якщо є забруднення.Тому необхідно вказати процес, який ви використовували для обробки ДНК, щоб продемонструвати, що ДНК під час експериментального процесу було повністю видалено.представлена ​​схематичною схемою.

Принципова схема РНК і ДНК
Загалом метод видалення ДНК полягає в обробці РНК ДНКазою після екстракції.Однак це відносно старі методи.Комерційні набори для екстракції РНК змогли видалити ДНК під час процесу екстракції без додавання ДНКази.Наприклад, серія комплектів від Foregene.

Примітка: Видалення ДНК під час екстракції РНК є дуже небезпечною палкою з двома кінцями, яка подовжить час операції екстракції РНК і збільшить ризик деградації РНК.

Крім того, кількість ДНКази, доданої в адсорбційну колонку на основі кремнезему, дуже мала, і для досягнення ефекту необхідно використовувати високоякісну ДНКазу.

Оцінка забруднення
метод оцінки: детекція електрофорезом, 1% агароза, 6 В/см, 15 хв, завантаження 1-3 мкл

Кількісний аналіз нуклеїнових кислот
зазвичай вимірюється за допомогою УФ спектрофотометра.Дозвольте мені спочатку популяризувати значення трьох значень OD260, OD280 і OD230.
·OD260 нм: це довжина хвилі поглинання найвищого піку поглинання нуклеїнової кислоти, а найкраще вимірюване значення коливається від 0,1 до 1,0.Якщо ні, розбавте або сконцентруйте зразок, щоб привести його в діапазон.
·OD280nm: це довжина хвилі поглинання найвищого піку поглинання білків і фенольних речовин.
·OD230nm: це довжина хвилі поглинання найвищого піку поглинання вуглеводів.

Далі поговоримо про роль кожного показника.Для A260 його можна використовувати для вимірювання виходу нуклеїнової кислоти.Коли OD260=1, дцДНК=50 мкг/мл, оцДНК=37 мкг/мл, РНК=40 мкг/мл.

Коли він перевищує 1,9, це вказує на забруднення РНК, а коли менше 1,6, це вказує на забруднення білком і фенолом.
· Чиста РНК: 1,7
·OD260/230: незалежно від того, чи це ДНК чи РНК, контрольне значення становить 2,5.

цілісність РНК

Як правило, необхідно провести гелевий експеримент денатурації РНК, щоб перевірити, чи є яскравість між 28S і 18S РНК подвійним зв’язком.

Дані для оцінки якості РНК: на додаток до вищевказаних тестів, існують також деякі більш просунуті інструментальні тести з точки зору цілісності РНК, такі як тест цілісності RQI автоматичної системи електрофорезу Experion, який може виявити, чи РНК непомітно деградує.

Як цілісність РНК впливає на баланс між цільовим геном і внутрішнім еталонним геном, можна легко зрозуміти на малюнку нижче.Деградація призведе до неповноти гена, будь то неповнота внутрішнього еталонного гена чи неповнота цільового гена, це матиме великий вплив на дані.

Беручи цю фігуру як приклад, значення Ct для п’яти кривих є такими.Розподіл значень CT між кривими є нерівномірним, і значення Ct затримуються при високих і низьких концентраціях, що є випадком інгібування ПЛР.

Ключовий момент: у процесі екстракції РНК нам потрібно відмовитися від помилкових уявлень і встановити правильні.

Неправильна ідея: екстракція РНК переслідує лише вихід, думаючи, що чим більша кількість отриманої РНК, тим краще.Фактично, коли ми робимо кількісне визначення, якщо кількість генів не дуже велика, нам не потрібно багато РНК.Кількість РНК, яку ви виділяєте, більш ніж достатня.

Правильна концепція:.Чистота може гарантувати, що подальша зворотна транскрипція не буде пригнічена, і дані не будуть залежати від ДНК.Цілісність забезпечує баланс цільових послідовностей і внутрішніх посилань.Консистенція забезпечує стабільне завантаження зразка.

MIQE (4) – зворотна транскрипція
Помилкове уявлення: прагнення збільшити обсяг вибірки.
Правильна концепція: Домагайтеся узгодженості (стабільності), незалежно від кількості завантаженої РНК, ефективність зворотної транскрипції залишається незмінною, гарантуючи, що відмінності в кДНК можуть справді відображати відмінності в мРНК.
Ми пояснюємо цей процес за допомогою схематичної діаграми:

Принципова схема ефективності зворотної транскрипції, не відповідає дійсності
Перш за все, нам потрібно зрозуміти різницю між процесом зворотної транскрипції та процесом ПЛР.ПЛР проходить кілька процесів нагрівання та відпалу, і цільовий фрагмент зростає експоненціально;в той час як зворотна транскрипція не має цього процесу, ми можемо уявити, що зворотна транскрипція насправді є один-до-одного Під час процесу реплікації стільки фрагментів РНК

оскільки можна отримати скільки завгодно шматочків інформації кДНК, це вже слід зрозуміти, оскільки великі та малі фрагменти були зворотно транскрибовані, і неможливо зосередитися на одному фрагменті.І оскільки кількість РНК відносно мала, кількість отриманої кДНК також відносно мала, на відміну від ПЛР, яка має ефект ампліфікації, тому її практично неможливо виявити.

Результати електрофорезу кДНК
По-друге, в ідеалі зворотна транскрипція виконується один до одного, але жодна зворотна транскриптаза жодної компанії не може досягти цього ефекту.В основному, ефективність більшості зворотних транскриптаз коливається в межах 30-50%.Якщо це так, ми воліємо мати відносно стабільну ефективність зворотної транскрипції, що ми хочемо бачити на малюнку: 3 РНК отримують 2 кДНК, 6 РНК отримують 4 кДНК, тому незалежно від того, скільки зразка завантажено, ефективність зворотної транскрипції є відносно стабільною.Ми не хочемо бачити ситуацію, коли ефективність зворотної транскрипції нестабільна, а висока концентрація пригнічується.

Отже, як перевірити, чи стабільна ефективність зворотної транскрипції?Метод дуже простий, вам потрібно лише провести порівняльний тест: один полягає в зворотній транскрипції в кДНК після подвоєння розведення РНК, а інший полягає в подвоєнні розведення після зворотної транскрипції в кДНК, а потім виконати кПЦР, щоб побачити отриманий нахил, чи відповідає він.Як кращий студент, ви повинні зрозуміти це за секунди.Як показано нижче:

Розведення РНК і кДНК для перевірки стабільності ефективності зворотної транскрипції
Зворотна транскриптаза та комплект
Як ідеальна флуоресцентна кількісна ПЛР може мати чудову зворотну транскриптазу та набір.Зворотна транскриптаза приблизно поділяється на два типи відповідно до джерела: AMV абоM-MLV, і їх продуктивність така ж, як і в таблиці.

Активність РНКази Н
РНКаза H — це рибонуклеаза H, китайська назва — рибонуклеаза H, яка є ендорибонуклеазою, яка може специфічно гідролізувати РНК у гібридному ланцюзі ДНК-РНК.РНКаза Н не може гідролізувати фосфодіефірні зв’язки в одноланцюговій або дволанцюговій ДНК або РНК, тобто вона не може перетравлювати одноланцюгову або дволанцюгову ДНК або РНК.Зазвичай використовується для синтезу другого ланцюга кДНК.

Дивна річ.Ми говоримо, що зворотна транскриптаза має активність РНКази Н, а не те, що зворотна транскриптаза містить РНКазу Н, і може бути неможливо відокремити РНКазу Н від зворотної транскриптази, можливо, через конформацію певних груп у зворотній транскриптазі. Ця активність спричинена зворотною транскриптазою.

Отже, незважаючи на більш високу ефективність зворотної транскрипції AMV, його активність РНКази H знижує вихід кДНК.Звичайно, виробники реагентів постійно оптимізують свої продукти, щоб максимально усунути активність РНКази Н у зворотній транскриптазі, щоб збільшити вихід кДНК.
Температура відпалу

Перегляньте малюнок вище для вторинної структури РНК при різних температурах і використовуйте онлайн-інструмент mFold, щоб визначити вторинну структуру цільового фрагмента за певних умов температури та концентрації солі.При 55 °C вторинна структура РНК все ще дуже складна, зворотна транскриптаза не може працювати, і вторинна структура не може бути повністю розкрита до 65 °C, тоді як оптимальна температура AMV і M-MLV набагато нижча за цю температуру.
що робити?Вторинна структура — це комплементарне з’єднання самої матриці, що призводить до сильної конкуренції між праймером і зворотною транскриптазою та матрицею, що призводить до ряду проблем, таких як низький E і погана повторюваність.

що робити?Тільки максимально підвищуйте температуру відпалу.

Багато виробників реагентів вдосконалюють свою зворотну транскриптазу за допомогою генної інженерії.Деякі підвищують температуру реакції, наприклад Jifan і Aidelai, а деякі видаляють активну групу ферменту РНКази H, щоб покращити спорідненість між ферментом і матрицею РНК.Висока спорідненість може конкурентно вичавити вторинну структуру та плавно прочитати, а також значно підвищити ефективність зворотної транскрипції.
Ключовий момент: Зворотна транскрипція є більш важливою для досягнення узгодженості ефективності зворотної транскрипції (ферменти мають бути не лише ефективними, але й стабільними), а не обсягом завантаженого зразка, якщо це не особливо великомасштабна флуоресцентна кількісна ПЛР, це взагалі буде неможливо.Кілька кДНК.
Різні виробники також доклали певних зусиль для досягнення послідовності.Наприклад, зараз більшість компаній випускають зворотню транскрипцію як стандартний комплект для продажу, що є хорошим вибором.
Наприклад, комплекти серії RT Easy від Foregene:

RT Easy I (Мастер-премікс для набору для синтезу кДНК першого ланцюга)

MIQE (5) – інформація про цільовий ген

Наведений вище малюнок пояснює
1. Чи є цей ген ефективним для повторних експериментів, як правило, можна перевірити повторними експериментами.
2. Ген ID, ви знаєте.
3. Довжина гена, загальна довжина цільового гена точно не проблема.Під час розробки праймерів переконайтеся, що довжина амплікону становить 80-200 bp, щоб забезпечити кращу ефективність ампліфікації.
4. Інформація про порівняння послідовності Blast, цільовий ген необхідно порівняти в генбанку, щоб запобігти неспецифічній ампліфікації.
5. Наявність псевдогенів.Зазвичай його позначають ψ.
У перші роки, коли ми вирішували проблему забруднення ДНК, ми часто звертали увагу на положення праймерів, екзонів та інтронів і зазвичай розглядали можливість проектування праймерів між інтронами, щоб уникнути ампліфікації ДНК.Будь ласка, дивіться малюнок нижче: чорний колір представляє інтрони, різні сині представляють екзони, рожевий колір представляє звичайні праймери, а яскраво-червоний колір представляє праймери, що охоплюють інтрон.

Схематично, ніколи не відповідає дійсності
Це здається ідеальним планом, але насправді в більшості випадків транс-інтронні праймери не такі чарівні, як уявляють, і вони також викликають неспецифічну ампліфікацію.
7. Прогнозування конформації.Знову використовуючи цей приклад, використовуйте онлайн-інструмент mFold, щоб визначити вторинну структуру цільового фрагмента за певної температури та концентрації солі.

Вторинна структура — це комплементарне з’єднання самого шаблону, що призведе до сильної конкуренції між праймером і з’єднанням з шаблоном, і ймовірність зв’язування з праймером буде меншою, що призведе до ряду проблем, таких як низький E і погана повторюваність.

MIQE (6) — Олігонуклеотиди qPCR

Настільки просто, що покидьки можуть сміятися, а ми можемо закінчити одним реченням: з’ясуйте послідовність і положення праймерного зонда та спосіб модифікації.Для методу очищення праймерів синтез праймерів зараз настільки дешевий, qPCR гідний PAGE і вище методів очищення, а інформація інструменту синтезу неважлива.
Щодо принципів розробки букварів, вам не потрібно запам’ятовувати їх напам’ять, оскільки більшість програм для розробки букварів або онлайн-інструментів можуть вирішити ці проблеми (рекомендований онлайн-інструмент primer3.ut.ee/), а 99,999% дизайну букварів не робиться вручну Подивіться, автор іноді створює сотні букварів на день, якщо ви читаєте один за одним, він стане косим.

1. Сконструюйте праймери поблизу 3'-кінця: у разі використання оліго dT-праймерів для синтезу першого ланцюга кДНК, враховуючи ефективність зворотної транскрипції та цілісність РНК, розроблені праймери потрібно сконструювати поблизу 3'-кінця, щоб покращити ефективність ампліфікації.Використовуйте зображення, щоб пояснити наступне (це неможливо зрозуміти):

Чому грунтовки повинні бути розроблені близько до кінця 3', це не має бути правдою

MIQE(7)—процес кПЛР

1. Набір для КПЦР
Відповідно до вимог MIQE ми повинні чітко описати повні умови реакції в статті, включаючи конфігурацію системи реакції ПЛР, який набір використовується, хто є виробником, наскільки велика реакційна система, чи використовується метод барвника чи метод зонду, налаштування програми ПЛР.Ветерани-водії обов’язково побачать, що поки вибрано комплект, наведена вище інформація в основному визначається.
В даний час виготовлення та виробництво флуоресцентних наборів для кількісної ПЛР є дуже зрілою технологією.Якщо ви не виберете дуже поганих виробників, ймовірність проблем невисока, але ми все ж хочемо поділитися з вами кількома моментами:
Фермент Taq гарячого старту:Найважливішою частиною ПЛР є гарячий стартовий фермент Taq.Ферменти гарячого старту на ринку, як правило, поділяються на два типи: один — це хімічно модифікований фермент гарячого старту (ви можете уявити його як заливання в парафін), а інший — це фермент гарячого старту для модифікації антитіл (зв’язування антиген-антитіло).Хімічна модифікація є раннім способом гарячого запуску ферментів.Коли досягається певна температура, фермент вивільняє свою активність.Модифікований антитілом фермент гарячого старту використовує біологічні методи для блокування активності ферменту.Коли досягається певна температура, антитіло буде денатуровано та інактивовано у вигляді білка, і активність ферменту буде включена в дію.

Однак яка з цього користь?Це так, активність вивільнення модифікованих антитілами ферментів є швидшою, ніж активність хімічно модифікованих ферментів, тому з точки зору чутливості модифіковані антитілами ферменти мають невелику перевагу, тому в наборах на ринку практично немає хімічно модифікованих ферментів.Якщо є, то технології цього виробника все ще застрягли в епосі тисячоліть.
Концентрація іонів магнію:Концентрація іонів магнію дуже важлива в реакції ПЛР.Концентрація іонів магнію також впливатиме на відпал праймерів, температуру плавлення матриці та продуктів ПЛР, тим самим впливаючи на вихід ампліфікованих фрагментів.Деякі продавці додають до реагенту хелатоутворювач іонів магнію, що дозволяє досягти ефекту автоматичного регулювання концентрації іонів магнію.
Концентрація флуоресцентного барвника:Флуоресцентний барвник, яким ми зазвичай користуємося SYBR Green, головним чином генерує флуоресценцію шляхом зв’язування з малою борозенкою дволанцюгової ДНК, оскільки зв’язування барвника з дволанцюговою ДНК є неспецифічним, тобто доки дволанцюгова ДНК поєднується з нею, може виникати флуоресценція, тому праймери-димери та шаблони ДНК у системі поєднуватимуться з нею, утворюючи фоновий сигнал. .
PS: завдяки своїм світлочутливим властивостям продукція на ринку зазвичай упаковується в коричневі непрозорі центрифужні пробірки (як показано на малюнку нижче).Однак це зіткнеться з проблемою.При відборі важко побачити, чи всмоктується рідина.У цьому відношенні Qingke справді є найбільш зручним для користувача (як показано на малюнку нижче), а прозорий тюбик упакований у непрозорий жерстяний пакет.Потім помістіть його в жерстяний мішок, беручи до уваги зручність уникати світла та взяття проб.Ви повинні вибрати правильний номер товару.TSE204 - це надзвичайно економічно ефективне існування, яке викликає у мене бажання садити траву.

Концентрація флуоресцентного барвника також дуже важлива.Якщо концентрація надто низька, крива ампліфікації не підніметься на пізній стадії та не є ідеальною;якщо концентрація занадто висока, це спричинить шумові перешкоди.Оскільки флуоресцентна кількісна ПЛР в основному залежить від значення КТ, якщо концентрація флуоресцентного барвника не відрегульована належним чином, нижня точка краща, ніж висока.Звичайно, найкращою є відповідна концентрація барвника.

ROX
Foregene's qPCR Mix також містить барвник ROX, який зручний для використання в різних моделях.

Набір для ПЛР у реальному часі Taqman

Обробка слабким водневим зв’язкомНасправді це так важливо.

Обсяг реакції: Частіше використовується система 20-50 мкл, і менші об’єми можуть викликати помилки.Загалом, в інструкції до набору буде рекомендовано використання реакційних об’ємів ПЛР.Не будьте мудрими і використовуйте менші обсяги, щоб заощадити кошти.мета.Обсяг, рекомендований продавцями, фактично перевірений, і можливо, вони не можуть вирішити проблему помилок, спричинених малими обсягами.
2. Виробник і артикул трубної пластини
Всім відомий принцип роботи флуоресцентної кількісної ПЛР.Збір флуоресценції в основному здійснюється через кришки пробірок для ПЛР.Вибираючи витратні матеріали для ПЛР, звертайте увагу на два моменти: хорошу світлопроникність і відповідність приладу.Взагалі плати і труби масових брендів підходять, але вибирати потрібно ретельно з точки зору адаптації, інакше ви не зможете використовувати інструмент.

4. Знання на найвищому рівні

MIQE (8) — валідація qPCR
Це головний пріоритет КПЦР!Тут стільки героїв провалилося в пісок.Звичайно, також можливо, що вам пощастило і гени, які ви вивчили, прості, тому ви пропливли крижаною печерою за вітром.Перевірочна інформація qPCR призначена для перевірки надійності даних.Ми перераховуємо необхідну інформацію для перевірки таким чином:

1. Тест на специфічність
Специфічність ампліфікації цільового гена перевіряється шляхом перевірки, чи є картина електрофорезу однією смугою;перевірка послідовності;крива плавлення, щоб побачити, чи карта піків є одиничною;перевірка ферментативного травлення та інші методи.
Тут ми зосередимося на tаналіз неспецифічної ампліфікації методом кривих плавлення.Загалом, коли ми розробляємо праймери, розмір фрагмента продукту повинен бути в діапазоні 80-200 bp, що робить температуру плавлення продукту ПЛР в діапазоні 80-85 °C.Отже, якщо є різні піки, повинні бути інші неспецифічні продукти посилення;якщо пік з'являється нижче 80°C, це зазвичай вважається димером праймера;якщо пік з’являється вище 85°C, це зазвичай вважається забрудненням ДНК або більш неспецифічною ампліфікацією великих фрагментів.
Примітка: іноді є лише один пік при 80°C.У цей час цієї концепції необхідно дотримуватися.Ймовірно, що всі результати ампліфікації є димерами праймерів.

Нормальна крива плавлення (один пік без неспецифічної ампліфікації)

Проблемна крива плавлення (неспецифічне посилення помилкових піків)
【Аналіз випадку】

Є основний пік, але димер грунтовки серйозний
Однопікова крива плавлення на малюнку нижче може легко ввести ваші очі в оману, подумавши, що це ідеальний експеримент, але результат абсолютно неправильний.У цей час ми повинні дивитися на температуру плавлення.Пікова температура нижче 80°C, що є повністю праймером.

Немає цільового фрагмента, усі димери праймера
Тут мій брат не може зупинитися.На малюнку нижче — фото, зроблене на мобільний телефон, яке мені надіслав покидьок.Усі реагенти, які він використовував, належать до загальновживаних марок у галузі.Він змінив одну марку з префіксом T на іншу.Думаю, ви вже здогадалися.Негідник мені крикнув: «На першій картинці реагент занадто хороший, а пік одиночний.Пізніше, після використання реагенту, який ви рекомендували, він стає таким, як на другому зображенні, зі змішаними піками.Ви зробили мене нещасним.«
На перший погляд, один має одинарний пік, а інший – подвійний.Нісенітниця, один пік, звичайно, добре.Це правда?
Гірше, ніж Dou E, якщо я поміщу два зображення на малюнку нижче, ви відразу зрозумієте.Насправді ми легко паралізуємося такою картиною.Після ретельного аналізу ми виявили, що: пік першої цифри знаходиться при 75°C, що повністю відповідає димеру праймера;пік другої цифри з'являється при 75°C і 82°C, принаймні там з'являється продукт.

Картинки відгуків учнів
Таким чином, основна проблема полягає не в проблемі реагентів, а в проблемі дизайну грунтовки.Водночас це також доводить, що деякі великі бренди не мають якості заліза, і це також доводить те, що мій брат сказав раніше: ваша стаття підтверджується не маркою реагентів.Саме ваша стаття підтримала марку реактивів.Тільки уявіть, якби покидьок не змінив реактиви, то в журнал потрапили б не ті дані, і сталося б трагедія.
2. Значення Ct холостого контролю
Не пояснюйте, якщо порожній контроль має значення Ct, чи це не забруднення?Однак вам все одно потрібно зрозуміти, який пустий елемент керування має значення Ct.Якщо це NTC, це означає наявність сторонньої ДНК, наприклад забруднення реагентом.
3. Стандартна крива
Включаючи нахил і формулу розрахунку, ефективність ПЛР можна розрахувати за допомогою формули.Ідеальний експеримент вимагає, щоб нахил стандартної кривої наближався до 3,32, а R² – до 0,9999.
4. Лінійний динамічний діапазон
Динамічний діапазон реакції лінійний.Відповідно до шаблону, який використовувався для створення стандартної кривої, динамічний діапазон повинен включати принаймні 5 градієнтів концентрації та звертати увагу на зміну значень Ct при високих градієнтах концентрації та низьких градієнтах концентрації.
5. Точність виявлення
Зміни в результатах КПЦР, тобто погана повторюваність, тобто низька точність, спричинені багатьма факторами, зокрема температурою, концентрацією та роботою.В ідеалі варіації в межах експерименту, ці технічні варіації мають відрізнятися від біологічних варіацій, а біологічні репліки можуть безпосередньо виправляти статистичні відмінності в результатах кПЦР між групами або методами лікування.Зокрема, для діагностичних аналізів необхідно повідомляти про найкращу точність між аналізами (повторюваність) для різних сайтів і операторів.
6. Ефективність виявлення та LOD (у мультиплексній кПЦР)

Проблеми та рішення
· Неспецифічне посилення
·Складний вибір концентрації праймерів і проблеми з праймерами-димерами
· Температура відпалу неточна
· Вторинна структура впливає на ефективність підсилення
неспецифічне посилення
неспецифічне посиленнятрапляється, як правило, вважається, чи не підходить дизайн праймерів, але якщо ви не поспішаєте змінювати праймери, ви можете спробувати наступні методи (принцип також додається):


· Зменшити концентрацію праймерів – зменшити ймовірність зв’язування надлишкових праймерів і нецільових областей;
Низька ефективність посилення

· Подовження часу відпалу та подовження;

·Збільшення концентрації праймера;
Ps

Вибір концентрації праймера Об’єднайте кожну концентрацію праймера в рядок таким чином:

У 100 нМ і 250 нМ значення Ct 250 нМ є відносно малим, тому оптимальна концентрація праймера становить 250 нМ.Як правило, суворі димери ґрунтовки можна побачити в кривій плавлення.Що робити, якщо розроблені праймери не можуть уникнути праймерів-димерів?

.

Вибір температури відпалу:

·67,3°C – на початку спостерігається невелике посилення, а значення Ct відносно велике.
·64,5°C——Зниження Ct.
· При 60,7 ° C, 58,0 ° C, 56,2 ° C та 55,0 ° С значення КТ в основному, як правило, стабільні, але кінцеві значення флуоресценції були різними.
Як вибрати?Принцип: Першим принципом є вище значення Ct.Для того самого значення Ct виберіть вищу температуру відпалу, щоб уникнути димеризації та неспецифічної ампліфікації.Незважаючи на те, що значення флуоресценції вище за 55°C, у ньому можуть бути димери або неспецифічне посилення.
Дійсно, поки температура відпалу оптимізована належним чином, вплив концентрації праймера на значення Ct природно буде мінімізовано.

Температура відпалу оптимізована належним чином, і вплив концентрації праймера на КТ буде мінімізовано
Вторинна структура впливає на ефективність підсилення
Давайте візьмемо зображення з Bio-rad, щоб проілюструвати проблему.

Виникає вторинна структура
Видно, що в міру зменшення градієнта температури продукти починають з’являтися і значення КТ рухається вперед, досягаючи мінімального значення при 60,7 ° C, а потім, коли градієнт температури зменшується, значення КТ стає більшим.І навпаки, при підвищенні температури вторинна структура розкривається і ефективність підсилення зростає.Після досягнення певної температури підвищення температури не може покращити ефективність підсилення.Оскільки наразі праймери неможливо стабільно поєднати.томушукайте температуру з найнижчим значенням Ct, що є найкращою температурою для посилення шаблону вторинної структури!Звичайно, розумні дурні повинні знати, що якщо це не потрібно, найкраще змінити праймери та уникати вторинної структури.

Аналіз даних в основному дає флуоресцентний прилад для кількісної ПЛР.Внутрішні еталонні гени, числа повторів тощо були уточнені., тут ми в основному пояснюємо застосування кПЦР.
КПЦР широко використовується, а експериментальна перевірка та діагностика нуклеїнових кислот є найбільш часто використовуваними сценаріями.

Log (початкова концентрація) має лінійну залежність від кількості циклів.За значенням Ct зразка можна розрахувати концентрацію в зразку.Кількість шаблонів для включення.

Абсолютний метод кількісного розрахунку
Абсолютна кількісна оцінка повинна базуватися на стандартній кривій.Щоб зробити стандартну криву, потрібен стандарт.Зазвичай стандартом є плазміда, отримана шляхом клонування цільового гена.Оскільки кільцева плазмідна ДНК є найбільш стабільною.Розбавте стандартний продукт у 5-6 градієнтах відповідно до коефіцієнта подвоєння (10-кратне розведення) та зверніть увагу на рівномірність при розведенні.Нехай значення Ct буде в межах 15-30.

Стандартний продукт + зразок для тестування поміщаються на машину разом.Після пробігу було зроблено стандартну криву зі стандартною речовиною, а зразки, які підлягають тестуванню, були введені в стандартну криву для обчислення концентрації.
Кількісне визначення вірусу гепатиту B HBV є типовим абсолютним кількісним визначенням, за допомогою якого можна розрахувати кількість копій вірусу в 1 мл крові.
Обчислення номера копії
Концентрація зразка для тестування (нг/мкл) = OD260 × 50 мкг/мл × коефіцієнт розведення
Молекулярна маса зразка = кількість основ × 324

Метод розрахунку кількості копій

Вищезазначений - метод розрахунку для визначення кількості.Якщо не розумієте, то можете приходити поспілкуватися.


Тому відносна кількісна оцінка повинна ввести елемент:внутрішній еталонний ген.
Через невеликий розмір вибірки як внутрішні еталонні гени, так і цільові гени були відносно зменшені.Ось чому ми раніше підкреслювали рівномірність та стабільність.
Внутрішні довідкові гени, як правило, є
Не плутайте це поняття.Гени домашнього господарства — це терміни біологічної функції, тоді як гени внутрішнього посилання — це експериментальні технічні терміни.Гени домашнього господарства повинні пройти перевірку, перш ніж їх можна буде вибрати як внутрішні референтні гени.
Наприклад, ми вибрали кілька генів господарства на малюнку нижче, щоб перевірити рівень їх експресії в різних тканинних клітинах, і виявили, що рівні експресії β-2-мікроглобуліну сильно відрізняються від рівня інших трьох генів, тому їх не можна було використовувати як внутрішні довідкові гени.

Після розуміння функції корекції внутрішнього референтного гена два алгоритми виводяться завдяки впровадженню внутрішнього референтного гена.
·метод подвійної стандартної кривої
· 2 - △△ метод КТ (метод порівняння значення КТ)
Якщо ви зацікавлені у вивченні видів та функцій генів, будь ласка, відмовляйтеся від досліджень алгоритмів та безпосередньо використовуйте формули або використовуйте машини безпосередньо;
метод подвійної стандартної кривої
Кількісно оцінити цільовий ген та ген господарства контрольного зразка та зразок, який слід перевірити через стандартну криву, а потім обчислити відносне значення відповідно до формули розрахунку, яка є відносним рівнем експресії.

Недолік: для кожного гена в кожному раунді експериментів має бути стандартна крива

Формула така:

Обчисліть відносну кількість на основі кількісного результату
2 – метод △△Ct (метод порівняння значень CT)

Переваги: ​​не потрібно робити стандартну криву
Недоліки: Передбачається, що ефективність підсилення близька до 100%;стандартне відхилення становить < 5%, а стандартна крива та ефективність між кожним посиленням вважаються узгодженими;оптимізація умов експерименту більш складна.

Звичайно, ефективність ампліфікації, як правило, неможливо бути ідеально 1. Метод корекції: якщо ми знаємо, що цільовий ген та еталонний ген мають однакову ефективність ампліфікації, але ефективність ампліфікації не дорівнює 1, то 2－ △△ ct може бути виправлена ​​як: (1+e) － △△ ct, наприклад, якщо ефективність ампліфікації - 0,95, тоді форма розрахунку, що відповідає виправленню 1, － △△ 0,95, тоді форма розрахунку може бути виправдана.