РНК не екстрагується або вихід РНК низький

Часто існують різні фактори, які впливають на ефективність відновлення, наприклад: вміст РНК у зразку тканини, метод операції, об’єм елюції тощо.

1. Під час роботи проводили льодову баню або кріогенне (4 °C) центрифугування.

Рекомендація: Працюйте при кімнатній температурі (15-25 °C) протягом усього процесу, не використовуйте крижану ванну та не центрифугуйте при низьких температурах.

2. Неналежне збереження зразка або надмірний час зберігання зразка.

Рекомендація: Зберігайте зразки при -80 °C або заморожуйте в рідкому азоті та уникайте повторного заморожування-розморожування;спробуйте використати свіжу тканину або культивовані клітини для виділення РНК.

3. Недостатній лізис зразка.

Рекомендація: під час гомогенізації тканини переконайтеся, що тканина достатньо гомогенізована, а клітини тканини достатньо розділені, щоб пояснити вивільнення РНК.

4. Елюент додано неправильно.

Рекомендація: переконайтеся, що ddH без РНКази₂О додають по краплях до середини мембрани очисної колонки.

5. Правильний об’єм абсолютного етанолу не був доданий до буфера RL2 або буфера RW2.

Рекомендація: дотримуйтесь інструкцій, додайте правильний об’єм абсолютного етанолу в буфер RL2 і буфер RW2 і добре перемішайте перед використанням набору.

6. Невідповідне дозування зразка тканини.

Рекомендація: використовуйте 10-20 мг тканини або (1-5) × 10⁶клітин на 500 мкл буфера RL1, оскільки надмірне використання тканин може призвести до зниження екстракції РНК.

7. Невідповідний об’єм елюювання або неповне елюювання.

Рекомендація: Об'єм елюювання очисної колонки становить 50-200 мкл;якщо ефект елюції незадовільний, рекомендується продовжити час розміщення при кімнатній температурі після додавання попередньо нагрітого ddH без РНКази₂О, наприклад, протягом 5-10 хв.

8. Очисна колонка має залишок етанолу після промивання буфером RW2.

Рекомендація: якщо є залишок етанолу після промивання буфера RW2, центрифугуйте порожню пробірку протягом 1 хвилини, час для операції центрифугування порожньої пробірки можна збільшити до 2 хвилин, або колонку для очищення можна помістити при кімнатній температурі на 5 хвилин, щоб належним чином видалити залишки етанолу.

Очищена РНК розкладається

Якість очищеної РНК залежить від таких факторів, як збереження зразка, забруднення РНКазою та маніпуляції тощо.

1. Зразки тканин не зберігаються вчасно.

Рекомендація: якщо зразки тканин або клітини не були використані вчасно після збору, негайно кріоконсервуйте при -80 °C або в рідкому азоті.Щоб виділити РНК, використовуйте щойно взяту тканину або зразок клітини, коли це можливо.

2. Повторне заморожування-відтавання зразків тканин.

Рекомендація: при зберіганні зразків тканин найкраще розрізати їх на невеликі шматочки для збереження та видалити один із шматочків під час їх використання, щоб уникнути повторного заморожування-розморожування зразка та деградації РНК.

3. РНКазу вводять або не надягають під час операції одноразові рукавички, маски тощо.

Рекомендація: Експерименти з екстракції РНК краще проводити в окремих кімнатах для маніпуляцій з РНК, а стіл очищають перед експериментом.

Одягайте одноразові рукавички та маски під час експерименту, щоб мінімізувати деградацію РНК, викликану введенням РНКази.

4. Реагенти забруднені РНКазою під час використання.

Рекомендація: замініть на новий набір для виділення загальної РНК тварин для відповідних експериментів.

5. Центрифужні пробірки, наконечники тощо, які використовуються для маніпуляцій з РНК, забруднені РНКазою.

Рекомендація: переконайтеся, що центрифужні пробірки, наконечники, піпетки тощо, які використовуються для екстракції РНК, не містять РНКази.

Очищена отримана РНК впливає на подальші експерименти

РНК, очищена очисною колонкою, якщо вміст іонів солі, білка занадто великий, вплине на подальший експеримент, наприклад: зворотна транскрипція, Northern Blot et al.

1. Елюована РНК містить залишки іонів солі.

Рекомендація: переконайтеся, що правильний об’єм етанолу додано до буфера RW2, і виконайте 2 промивання очисної колонки на відцентровій швидкості, вказаній для роботи;якщо є будь-який залишок іонів солі, залиште колонку для очищення буфера RW2 на 5 хвилин при кімнатній температурі та виконайте центрифугування, щоб максимально видалити сольове забруднення.

2. Залишок етанолу в елюйованій РНК.

Рекомендація: переконайтеся, що після промивання буфера RW2 виконайте операцію центрифугування порожніх пробірок із вказаною для роботи швидкістю центрифугування, збільште час операції центрифугування порожніх пробірок до 2 хв, якщо все ще є залишок етанолу, або залиште пробірку при кімнатній температурі на 5 хв.