Пояснення основних термінів молекулярної біології
1. кДНК і кккДНК: кДНК — це дволанцюгова ДНК, синтезована зворотною транскриптазою з мРНК;cccDNA - це плазмідна дволанцюгова замкнута кільцева ДНК, вільна від хромосоми.
2. Стандартна одиниця згортання: вторинна структурна одиниця білка α-спіраль і β-лист можуть утворювати структурні блоки зі спеціальним геометричним розташуванням за допомогою різних сполучних поліпептидів.Цей тип детермінованої складчастості зазвичай називають супервторинною структурою.Майже всі третинні структури можна описати цими типами складчастості, і навіть їх комбінованими типами, тому їх ще називають стандартними одиницями складчастості.
3. CAP: білок рецептора циклічного аденозинмонофосфату (cAMP) CRP (білок рецептора cAMP), комплекс, утворений після комбінації cAMP і CRP, називається активуючим білком CAP (білок, активований cAMP)
4. Паліндромна послідовність: зворотна комплементарна послідовність сегмента фрагмента ДНК, часто сайту рестрикції.
5. мікроРНК: комплементарна інтерферуюча РНК або антисмислова РНК, яка є комплементарною послідовності мРНК і може інгібувати трансляцію мРНК.
6. Рибозим: РНК з каталітичною активністю, яка відіграє автокаталітичну роль у процесі сплайсингу РНК.
7. Мотив: у просторовій структурі білкових молекул є деякі локальні області зі схожою тривимірною формою та топологією.
8. Сигнальний пептид: пептид із 15-36 амінокислотними залишками на N-кінці під час синтезу білка, який направляє трансмембрану білка.
9. Атенюатор: нуклеотидна послідовність між областю оператора та структурним геном, який припиняє транскрипцію.
10. Чарівна точка: коли бактерії ростуть і стикаються з повною нестачею амінокислот, бактерії вироблять екстрену реакцію, щоб зупинити експресію всіх генів.Сигнали, які генерують цю екстрену реакцію, це гуанозинтетрафосфат (ppGpp) і гуанозинпентафосфат (pppGpp).Роль PpGpp і pppGpp полягає не в одному або декількох оперонах, а в дії на велику їх кількість, тому їх називають суперрегуляторами або магічними плямами.
11. Промоторний елемент вище за течією: відноситься до послідовності ДНК, яка відіграє регуляторну роль у активності промотору, наприклад TATA в області -10, TGACA в області -35, енхансери та атенюатори.
12. ДНК-зонд: мічений сегмент ДНК з відомою послідовністю, який широко використовується для виявлення невідомих послідовностей і скринінгу цільових генів.
13. Послідовність SD: це послідовність зв’язування рибосоми та мРНК, яка регулює трансляцію.
14. Моноклональне антитіло: антитіло, яке діє лише проти однієї антигенної детермінанти.
15. Косміда: це штучно сконструйований екзогенний вектор ДНК, який зберігає ділянки COS на обох кінцях фага та з’єднаний із плазмідою.
16. Скринінг біло-блакитної плями: ген LacZ (кодує β-галактозидазу), фермент може розщеплювати хромогенний субстрат X-gal (5-бром-4-хлор-3-індол-β-D-галактозид) для отримання синього кольору, таким чином роблячи штам синім.Коли екзогенна ДНК вставляється, ген LacZ не може бути експресований, і штам білий, щоб перевірити рекомбінантні бактерії.Це називається синьо-білим екрануванням.
17. Цис-діючий елемент: специфічна послідовність основ у ДНК, яка регулює експресію генів.
18. Фермент Кленова: великий фрагмент ДНК-полімерази I, за винятком того, що 5' 3' екзонуклеазна активність видалена з голоферменту ДНК-полімерази I
19. Прикріплена ПЛР: використовується для ампліфікації цікавої ДНК з відомою послідовністю на одному кінці.Хвіст poly-dG додавали до одного кінця невідомої послідовності, а потім poly-dC і відому послідовність використовували як праймери для ПЛР-ампліфікації.
20. Злитий білок: ген еукаріотичного білка з'єднаний з екзогенним геном, і білок, що складається з трансляції вихідного генного білка та екзогенного білка, експресується одночасно.
Інші терміни молекулярної біології
1. Фізична карта ДНК — це порядок розташування фрагментів (розщеплених ендонуклеазою рестрикції) молекули ДНК.
2. Розщеплення РНКази ділиться на два типи (автокаталіз) і (гетерокаталіз).
3. Існує три фактори ініціації у прокаріотів: (IF-1), (IF-2) і (IF-3).
4. Трансмембранні білки вимагають керівництва (сигнальні пептиди), і роль білків-шаперонів (допомагає згортати пептидний ланцюг у нативну конформацію білка).
5. Елементи в промоторах загалом можна розділити на два типи: (основні промоторні елементи) і (передні промоторні елементи).
6. Зміст дослідження молекулярної біології в основному включає три частини: (структурна молекулярна біологія), (експресія та регуляція генів) і (технологія рекомбінації ДНК).
7. Два ключових експерименти, які демонструють, що ДНК є генетичним матеріалом, це (пневмококова інфекція мишей) і (Т2-фагова інфекція Escherichia coli).потенціал).
8. Існують дві основні відмінності між гнРНК і мРНК: (гнРНК сплайсується в процесі перетворення в мРНК), (5'-кінець мРНК додається кепкою m7pGppp, і є додаткове поліаденілування на 3'-кінці кислотного хвоста мРНК (polyA).
9. Перевагами білкової форми з кількома субодиницями є (субодиниця є економічним методом утилізації ДНК), (може зменшити вплив випадкових помилок у синтезі білка на активність білка), (активність може дуже ефективно та швидко відкриватися та закриватися).
10. Основний зміст механізму згортання білків перша теорія нуклеації включає (нуклеацію), (структурне збагачення), (остаточну перебудову).
11. Галактоза має подвійну дію на бактерії;з одного боку (можна використовувати як джерело вуглецю для росту клітин);з іншого боку (він також є компонентом клітинної стінки).Тому для постійного синтезу на фоновому рівні необхідний цАМФ-СРБ-незалежний промотор S2;в той же час, cAMP-CRP-залежний промотор S1 необхідний для регулювання синтезу високого рівня.Транскрипція починається з (S2) з G і з (S1) без G.
12. Технологія рекомбінантної ДНК також відома як (клонування генів) або (молекулярне клонування).Кінцева мета (перенести ДНК генетичної інформації в одному організмі в інший організм).Типовий експеримент з рекомбінації ДНК зазвичай включає наступні етапи: (1) Видалення цільового гена (або екзогенного гена) донорського організму та ферментативне з’єднання його з іншою молекулою ДНК (клонуючий вектор) для утворення нової рекомбінантної молекули ДНК.② Молекула рекомбінантної ДНК переноситься в клітину-реципієнт і реплікується в клітині-реципієнті.Цей процес називається трансформацією.③ Відкрийте та ідентифікуйте клітини-реципієнти, які поглинули рекомбінантну ДНК.④Культивуйте клітини, що містять рекомбінантну ДНК у великих кількостях, щоб виявити, чи експресується ген чужорідної допомоги.
13. Існує два типи реплікації плазмід: ті, які суворо контролюються синтезом білка клітини-хазяїна, називаються (щільними плазмідами), а ті, які суворо не контролюються синтезом білка клітини-господаря, називаються (розслабленими плазмідами).
14. Реакційна система ПЛР повинна мати такі умови: a.Праймери ДНК (приблизно 20 основ) з комплементарними послідовностями на кожному кінці двох ланцюгів гена-мішені, який потрібно розділити.b.Термостабільні ферменти, такі як: TagDNA полімераза.c, dNTPd, цікава послідовність ДНК як шаблон
15. Основний реакційний процес ПЛР включає три стадії: (денатурація), (відпал) і (подовження).
16. Основний процес трансгенних тварин зазвичай включає: ①Введення клонованого чужорідного гена в ядро заплідненої яйцеклітини або ембріональної стовбурової клітини;②Трансплантація щепленої заплідненої яйцеклітини або ембріональної стовбурової клітини в жіночу матку;③Повний ембріональний розвиток і ріст Для потомства з чужорідними генами;④ Використовуйте цих тварин, які можуть виробляти чужорідні білки, як племінне поголів’я для виведення нових гомозиготних ліній.
17. Клітинні лінії гібридоми утворюються шляхом гібридизації клітин (селезінки B) з клітинами (мієломи), і оскільки (клітини селезінки) можуть використовувати гіпоксантин, а (клітини кістки) забезпечують функції поділу клітин, їх можна вирощувати в середовищі HAT.рости.
18. З поглибленням досліджень перше покоління антитіл називають (поліклональні антитіла), друге покоління (моноклональні антитіла), третє покоління (генно-інженерні антитіла).
19. Зараз генна інженерія вірусів комах зосереджена переважно на бакуловірусі, що проявляється у впровадженні (ген екзогенного токсину);(гени, що порушують нормальний життєвий цикл комах);(модифікація генів вірусів).
20. Трансактивними білковими факторами, що відповідають загальним елементам TATA, GC і CAAT у промоторі РНК-полімерази II ссавців, є (TFIID), (SP-1) і (CTF/NF1), відповідно.
двадцять один.Основними факторами транскрипції РНК-полімерази Ⅱ є TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, а їх послідовність зв’язування така: (D, A, B, E).Де функцією TFII-D є (зв’язування з блоком TATA).
двадцять два.Більшість факторів транскрипції, які зв’язуються з ДНК, працюють у формі димерів.Функціональні домени транскрипційних факторів, які зв’язуються з ДНК, зазвичай такі (спіраль-поворот-спіраль), (мотив цинкового пальця), (основний лейцин) мотив блискавки).
двадцять три.Існує три типи режимів розщеплення ендонуклеазою рестрикції: (розріз на стороні 5' від осі симетрії для створення 5' липких кінців), (розріз на стороні 3' від осі симетрії для створення 3' липких кінців (розріз на осі симетрії для створення плоских сегментів)).
двадцять чотири.Плазмідна ДНК має три різні конфігурації: (SC-конфігурація), (oc-конфігурація), (L-конфігурація).Першим в електрофорезі є (SC конфігурація).
25. Екзогенні системи експресії генів, головним чином (Escherichia coli), (Дріжджі), (Комахи) і (Таблиця клітин ссавців).
26. Зазвичай використовувані методи для трансгенних тварин: (метод ретровірусної інфекції), (метод мікроін'єкції ДНК), (метод ембріональних стовбурових клітин).
Застосування Молекулярна біологія
1. Назвіть функції більше 5 РНК?
Переносна РНК тРНК Переносна амінокислота Рибосомна РНК рРНК Рибосома становить матричну РНК мРНК Шаблон синтезу білка Гетерогенна ядерна РНК гнРНК Попередник зрілої мРНК мала ядерна РНК мнРНК Залучена до сплайсингу гнРНК Мала цитоплазматична РНК білок scRNA/7SL-РНК Плазматичний ретикулум локалізований і синтезований у розпізнаванні сигналу компоненти тіла Антисмислові РНК anRNA/micRNA Регулює експресію генів Рибозим РНК Ферментативно активна РНК
2. У чому полягає основна відмінність між прокаріотичними та еукаріотичними промоторами?
Прокаріотичний TTGACA --- TATAAT------Сайт ініціації-35 -10 Еукаріотичний енхансер---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Сайт ініціації-110 -70 -25
3. Які основні аспекти штучного конструювання природних плазмід?
Природні плазміди часто мають дефекти, тому вони непридатні для використання як носії для генної інженерії, тому їх необхідно модифікувати та сконструювати: a.Додайте відповідні гени-маркери відбору, наприклад два або більше, які легко використовувати для відбору, як правило, гени антибіотиків.b.Збільште або зменшіть відповідні ділянки різання ферменту, щоб полегшити рекомбінацію.в.Скоротити довжину, відрізати непотрібні фрагменти, підвищити ефективність імпорту та збільшити вантажопідйомність.d.Змініть реплікон з щільного на вільний, з меншої кількості копій на більшу кількість копій.д.Додайте спеціальні генетичні елементи відповідно до особливих вимог генної інженерії
4. Наведіть приклад методу диференційного скринінгу тканиноспецифічної кДНК?
Готують дві клітинні популяції, цільовий ген експресується або сильно експресується в одній із клітин, а цільовий ген не експресується або має низьку експресію в іншій клітині, а потім цільовий ген знаходять шляхом гібридизації та порівняння.Наприклад, під час виникнення та розвитку пухлин пухлинні клітини представлятимуть мРНК з іншими рівнями експресії, ніж нормальні клітини.Таким чином, гени, пов’язані з пухлиною, можна відсіювати шляхом диференціальної гібридизації.Метод індукції також можна використовувати для відсіювання генів, експресія яких індукується.
5. Створення та скринінг гібридомних клітинних ліній?
В-клітини селезінки + клітини мієломи, додайте поліетиленгліколь (ПЕГ) для сприяння злиттю клітин, і злиті клітини В-мієломи селезінки, вирощені в середовищі HAT (що містить гіпоксантин, аміноптерин, Т), продовжують розширюватися і живитися.Злиття клітин містить: клітини злиття селезінки та селезінки: нездатні до росту, клітини селезінки не можна культивувати in vitro.Клітини злиття кісток і кісток: не можуть використовувати гіпоксантин, але можуть синтезувати пурин через другий шлях за допомогою фолатредуктази.Аміноптерин пригнічує фолатредуктазу і тому не може рости.Клітини злиття кістки та селезінки: можуть рости в HAT, клітини селезінки можуть використовувати гіпоксантин, а клітини кістки забезпечують функцію поділу клітин.
6. Який принцип і спосіб визначення первинної структури ДНК методом дідезокситермінації (метод Сенгера)?
Принцип полягає у використанні термінатора нуклеотидного ланцюга — 2,,3,-дидезоксинуклеотиду для припинення подовження ДНК.Оскільки в ньому відсутній 3-OH, необхідний для утворення 3/5/фосфодіефірних зв’язків, після включення в ланцюг ДНК ланцюг ДНК не може бути подовжений далі.Відповідно до принципу спарювання основ, якщо ДНК-полімеразі потрібен dNMP для участі в нормально розширеному ланцюзі ДНК, є дві можливості: одна полягає в участі в ddNTP, що призводить до припинення подовження дезоксинуклеотидного ланцюга;інший – брати участь у dNTP, щоб ланцюг ДНК міг продовжувати розширюватися, доки не буде включено наступний ddNTP.За цим методом можна отримати групу фрагментів ДНК різної довжини, що закінчуються на ddNTP.Метод полягає в розділенні на чотири групи відповідно ddAMP, ddGMP, ddCMP і ddTMP.Після реакції електрофорез у поліакриламідному гелі може зчитувати послідовність ДНК відповідно до плавальних смуг.
7. Який позитивний регуляторний вплив білка-активатора (CAP) на транскрипцію?
Білок рецептора циклічного аденілату (цАМФ) CRP (білок рецептора цАМФ), комплекс, утворений комбінацією цАМФ і СРБ, називається CAP (білок, активований цАМФ).Коли кишкову паличку вирощують у середовищі без глюкози, синтез CAP збільшується, і CAP виконує функцію активації промоторів, таких як лактоза (Lac).Деякі CRP-залежні промотори не мають типової ознаки послідовності регіону -35 (TTGACA), яку мають звичайні промотори.Тому РНК-полімеразі важко з ним зв’язатися.Наявність CAP (функція): може значно покращити константу зв'язування ферменту та промотора.В основному він показує наступні два аспекти: ① CAP допомагає молекулі ферменту правильно орієнтуватися, змінюючи конформацію промотору та взаємодію з ферментом, щоб поєднуватися з областю -10 і відігравати роль заміни функції області -35.②CAP також може інгібувати зв’язування РНК-полімерази з іншими ділянками в ДНК, тим самим збільшуючи ймовірність зв’язування з її специфічним промотором.
8. Які етапи зазвичай включають типовий експеримент з рекомбінації ДНК?
a.Витягніть цільовий ген (або екзогенний ген) донорського організму та ферментативно з’єднайте його з іншою молекулою ДНК (клонуючий вектор), щоб утворити нову рекомбінантну молекулу ДНК.b.Перенесіть рекомбінантну молекулу ДНК у клітину-реципієнт і відтворіть і збережіть її в клітині-реципієнті.Цей процес називається трансформацією.в.Відкрийте та ідентифікуйте клітини-реципієнти, які поглинули рекомбінантну ДНК.d.Масово культивуйте клітини, що містять рекомбінантну ДНК, щоб виявити, чи експресується ген чужорідної допомоги.
9. Конструювання бібліотеки генів Наведено три методи скринінгу рекомбінантів і коротко описано процес.
Скринінг антибіотикорезистентності, інсерційна інактивація резистентності, синьо-білий скринінг або ПЛР-скринінг, диференціальний скринінг, ДНК-зонд. Більшість векторів для клонування несуть гени стійкості до антибіотиків (антиампіцилін, тетрациклін).Коли плазміду переносять у Escherichia coli, бактерії набувають резистентності, а бактерії без перенесення не матимуть резистентності.Але воно не може розрізнити, чи було воно реорганізоване чи ні.У векторі, що містить два гени резистентності, якщо чужорідний фрагмент ДНК вставляється в один із генів і спричиняє інактивацію гена, для скринінгу на наявність позитивних рекомбінантів можна використовувати два контролі чашки, що містять різні препарати.Наприклад, плазміда pUC містить ген LacZ (кодує β-галактозидазу), який може розкладати хромогенний субстрат X-gal (5-бром-4-хлор-3-індол-β-D-галактозид) з утворенням синього кольору, таким чином забарвлюючи штам у синій колір.Коли вставляється чужорідна ДНК, ген LacZ не може бути експресований, і штам є білим, щоб перевірити рекомбінантні бактерії.
10. Поясніть основний процес отримання трансгенних тварин через ембріональні стовбурові клітини?
Ембріональні стовбурові клітини (ES) — це ембріональні клітини під час ембріонального розвитку, які можна штучно культивувати та розмножувати, а також виконувати функцію диференціювання в інші типи клітин.Культура клітин ES: внутрішню клітинну масу бластоцисти виділяють і культивують.Коли ES культивують у вільному від годівниці шарі, він буде диференціюватися в різні функціональні клітини, такі як м’язові клітини та N-клітини.При культивуванні в середовищі, що містить фібробласти, ES буде підтримувати функцію диференціювання.ES можна генетично маніпулювати, і його функцію диференціації можна інтегрувати, не впливаючи на її функцію диференціювання, що вирішує проблему випадкової інтеграції.Ввести екзогенні гени в ембріональні стовбурові клітини, потім імплантувати в матку вагітних самок мишей, розвивати дитинчат і схрещувати для отримання гомозиготних мишей.
