Немає сигналів посилення

1. ДНК-полімераза Taq у наборі втрачає свою активність через неправильне зберігання або закінчення терміну придатності набору.
Рекомендація: Перевірте умови зберігання набору;повторно додайте відповідну кількість ДНК-полімерази Taq до системи ПЛР або придбайте новий набір для ПЛР у реальному часі для відповідних експериментів.

2. Є багато інгібіторів Taq ДНК-полімерази в матриці ДНК.
Пропозиція: повторно очистіть шаблон або зменшіть його кількість.

3. Концентрація Mg2+ не підходить.
Рекомендація: Концентрація Mg2+ у суміші 2× Real PCR Mix, яку ми надаємо, становить 3,5 мМ.Однак для деяких спеціальних праймерів і шаблонів концентрація Mg2+ може бути вищою.Таким чином, ви можете безпосередньо додати MgCl2 для оптимізації концентрації Mg2+.Для оптимізації рекомендується щоразу збільшувати Mg2+ на 0,5 мМ.

4. Умови ПЛР-ампліфікації невідповідні, а послідовність або концентрація праймера невідповідна.
Пропозиція: підтвердьте правильність послідовності праймерів і праймер не був деградований;якщо сигнал посилення поганий, спробуйте знизити температуру відпалу та відповідним чином відрегулювати концентрацію праймера.

5. Обсяг шаблону занадто малий або забагато.
Рекомендація: виконайте градієнтне розведення лінеаризації шаблону та виберіть концентрацію шаблону з найкращим ефектом ПЛР для експерименту ПЛР у реальному часі.

NTC має занадто високе значення флуоресценції

1. Забруднення реагентом під час роботи.
Рекомендація: замініть на нові реагенти для експериментів ПЛР у реальному часі.

2. Зараження відбулося під час підготовки реакційної системи ПЛР.
Рекомендація: вживайте необхідних заходів захисту під час роботи, таких як: носіння латексних рукавичок, використання наконечника піпетки з фільтром тощо.

3. Праймери руйнуються, і руйнування праймерів спричинить неспецифічну ампліфікацію.
Пропозиція: використовуйте електрофорез SDS-PAGE, щоб виявити, чи праймери деградували, і замініть їх новими праймерами для експериментів ПЛР у реальному часі.

Праймерний димер або неспецифічна ампліфікація

1. Концентрація Mg2+ не підходить.
Рекомендація: Концентрація Mg2+ у суміші 2× Real PCR EasyTM Mix, яку ми надаємо, становить 3,5 мМ.Однак для деяких спеціальних праймерів і шаблонів концентрація Mg2+ може бути вищою.Таким чином, ви можете безпосередньо додати MgCl2 для оптимізації концентрації Mg2+.Для оптимізації рекомендується щоразу збільшувати Mg2+ на 0,5 мМ.

2. Температура відпалу ПЛР занадто низька.
Пропозиція: щоразу підвищуйте температуру відпалу ПЛР на 1 ℃ або 2 ℃.

3. Продукт ПЛР занадто довгий.
Рекомендація: довжина продукту ПЛР у реальному часі має становити 100-150 bp, але не більше 500 bp.

4. Праймери деградують, і деградація праймерів призведе до появи специфічної ампліфікації.
Пропозиція: використовуйте електрофорез SDS-PAGE, щоб виявити, чи праймери деградували, і замініть їх новими праймерами для експериментів ПЛР у реальному часі.

5. Система ПЛР неналежна, або система замала.
Порада: занадто мала реакційна система ПЛР призведе до зниження точності визначення.Найкраще використовувати реакційну систему, рекомендовану приладом для кількісної ПЛР, для повторного проведення експерименту з ПЛР у реальному часі.

Погана повторюваність кількісних значень

1. Прилад несправний.
Пропозиція: між кожним ПЛР-отвором приладу можуть бути помилки, що призводить до поганої відтворюваності під час керування температурою або виявлення.Будь ласка, перевірте відповідно до інструкцій відповідного приладу.

2. Чистота зразка погана.
Рекомендація: нечисті зразки призведуть до поганої відтворюваності експерименту, що включає чистоту шаблону та праймерів.Найкраще повторно очистити шаблон, а праймери найкраще очищати SDS-PAGE.

3. Час підготовки та зберігання ПЛР-системи надто довгий.
Порада: використовуйте систему ПЛР у реальному часі для ПЛР-експерименту одразу після підготовки та не залишайте її надовго.

4. Умови ПЛР-ампліфікації невідповідні, а послідовність або концентрація праймера невідповідна.
Пропозиція: підтвердьте правильність послідовності праймерів і праймер не був деградований;якщо сигнал посилення поганий, спробуйте знизити температуру відпалу та відповідним чином відрегулювати концентрацію праймера.

5. Система ПЛР неналежна, або система замала.
Порада: занадто мала реакційна система ПЛР призведе до зниження точності визначення.Найкраще використовувати реакційну систему, рекомендовану приладом для кількісної ПЛР, для повторного проведення експерименту з ПЛР у реальному часі.