Добре відомо, що в центральній догмі РНК є транскрипційним посередником між експресією ДНК і білка.Порівняно з виявленням ДНК, виявлення РНК може більш об’єктивно відображати експресію генів в організмах.Експерименти за участю РНК включають: qRT-PCR, RNA-Seq та виявлення злитого гена тощо. Виходячи з характеристик самої РНК (цукрове кільце РНК має одну вільну гідроксильну групу більше, ніж цукрове кільце ДНК), у поєднанні з великою кількістю РНКаз у навколишньому середовищі, РНК є більш нестабільною та легше розкладається, ніж ДНК.Сміття входить, сміття виходить, якщо якість РНК погана, то експериментальні результати повинні бути незадовільними, зокрема, проявлятися як неточні дані або погана повторюваність.Тому більше уваги слід приділяти обробці РНК, а зв'язок контролю якості також важливіша для забезпечення точності та точності подальших експериментальних даних.

Для контролю якості РНК зазвичай використовуються такі методи:

• Спектрофотометрія
• електрофорез в агарозному гелі
• Біоаналізатор Agilent
• флуоресцентна кількісна ПЛР в реальному часі
• Метод флуоресцентного барвника Qubit

01 Спектрофотометрія

РНК має кон’юговані подвійні зв’язки та має пік поглинання на довжині хвилі 260 нм.Відповідно до закону Ламберта-Бера, ми можемо розрахувати концентрацію РНК за піком поглинання при 260 нм.Крім того, ми також можемо розрахувати чистоту РНК відповідно до співвідношення піків поглинання 260 нм, 280 нм і 230 нм.280 нм і 230 нм — це піки поглинання білків і малих молекул відповідно.Співвідношення A260/A280 і A260/A230 кваліфікованої чистоти РНК має бути більше 2. Якщо воно менше 2, це означає, що в зразку РНК міститься білок або невеликі молекули, і його потрібно повторно очистити.Джерела забруднення впливатимуть на наступні експерименти, наприклад, пригнічуватимуть ефективність ампліфікації реакцій ПЛР, що призведе до неточних кількісних результатів.Чистота РНК має великий вплив на наступні результати, тому спектрофотометрія, як правило, є незамінною ланкою контролю якості на першому етапі експериментів з нуклеїновими кислотами.

Рисунок 1. Типовий спектр поглинання РНК/ДНК

02 Електрофорез у агарозному гелі

Окрім чистоти, цілісність РНК також є одним із важливих показників для оцінки якості РНК.Деградація РНК призведе до появи великої кількості коротких фрагментів у зразку, тому кількість фрагментів РНК, які можуть бути ефективно виявлені та покриті еталонною послідовністю, буде зменшено.Цілісність РНК можна перевірити електрофорезом загальної РНК на 1% агарозному гелі.За допомогою цього методу можна налаштувати гель самостійно або використати готову систему E-Gel™ для перевірки цілісності.Більше 80% загальної РНК є рибосомною РНК, більшість з яких складається з 28S і 18S рРНК (у системах ссавців).РНК хорошої якості показуватиме дві очевидні яскраві смужки, які є яскравими смугами 28S і 18S відповідно, на 5 Кб і 2 Кб, і співвідношення буде близьким до 2:1.Якщо він знаходиться в дифузному стані, це означає, що зразок РНК, можливо, був деградований, і рекомендується використовувати метод, описаний нижче, для подальшого тестування якості РНК.

Рисунок 2. Порівняння деградованої (доріжка 2) та інтактної РНК (доріжка 3) на електрофорезі в агарозному гелі

03 Біоаналізатор Agilent

Окрім описаного вище методу електрофорезу в агарозному гелі, який може допомогти нам просто та швидко визначити цілісність РНК, ми також можемо використовувати біоаналізатор Agilent для визначення цілісності РНК.Він використовує комбінацію мікрофлюїдики, капілярного електрофорезу та флуоресценції для оцінки концентрації та цілісності РНК.Використовуючи вбудований алгоритм для аналізу профілю зразка РНК, біоаналізатор Agilent може розрахувати еталонне значення цілісності РНК, RNA Integrity Number (надалі RIN) [1].Чим більше значення RIN, тим вища цілісність РНК (1 – надзвичайно деградована, 10 – найбільш повна).Деякі експерименти з використанням РНК пропонують використовувати RIN як параметр для оцінки якості.Взявши за приклад експерименти з високопродуктивним секвенуванням (надалі NGS), рекомендації Oncomine™ Human Immune Repertoire, які використовуються для виявлення рецепторів антигену B-клітин і T-клітин у серії панелей Thermo Fisher Oncomine, свідчать про те, що зразки зі значеннями RIN більше 4 можна виміряти більш ефективні зчитування та клони (рис. 3).Існують різні рекомендовані діапазони для різних панелей, і часто вищий RIN може надати ефективніші дані.

На рисунку 3 в експериментах Oncomine™ Human Immune Repertoire зразки з RIN більше 4 можуть виявити більш ефективні зчитування та клони Т-клітин.【2】

Однак значення RIN також має деякі обмеження.Хоча RIN має високу кореляцію з якістю експериментальних даних NGS, він не підходить для зразків FFPE.Зразки FFPE протягом тривалого часу піддавалися хімічній обробці, і екстрагована РНК зазвичай має відносно низьке значення RIN.Однак це не означає, що ефективні дані експерименту повинні бути незадовільними.Щоб точно оцінити якість зразків FFPE, нам потрібно використовувати вимірювання, відмінні від RIN.Крім RIN, біоаналізатор Agilent також може розрахувати значення DV200 як параметр оцінки якості РНК.DV200 — це параметр, який обчислює частку фрагментів розміром понад 200 bp у зразку РНК.DV200 є кращим показником якості зразка FFPE, ніж RIN.Для РНК, виділеної за допомогою FFPE, вона має дуже високу кореляцію з кількістю генів, які можуть бути ефективно виявлені, і різноманітністю генів [3].Незважаючи на те, що DV200 може компенсувати недоліки в якісному виявленні FFPE, біоаналізатор Agilent все ще не може всебічно проаналізувати проблеми якості в зразках РНК, включно з тим, чи є в зразках інгібітори.Самі інгібітори можуть впливати на ефективність посилення подальших експериментів і зменшувати кількість корисних даних.Щоб дізнатися, чи є інгібітор у зразку, ми можемо застосувати кількісний метод флуоресцентної ПЛР у реальному часі, описаний далі.

04 флуоресцентна кількісна ПЛР в реальному часі

Метод флуоресцентної кількісної ПЛР у реальному часі може не тільки виявити інгібітори у зразку, але й точно відобразити якість РНК у зразку FFPE.Порівняно з біологічними аналізаторами Agilent кількісні інструменти флуоресценції в режимі реального часу є більш популярними у великих біологічних лабораторіях через їх ширше застосування.Щоб перевірити якість зразків РНК, нам потрібно лише придбати або підготувати праймерні зонди для внутрішніх еталонних генів, таких як GUSB (кат. № Hs00939627).Використовуючи цей набір праймерів, зондів і стандартів (загальна РНК відомої концентрації) для проведення абсолютних кількісних експериментів, ефективну концентрацію фрагмента РНК можна розрахувати як стандарт оцінки якості РНК (скорочено кількісне визначення функціональної РНК (FRQ).У тесті NGS ми виявили, що FRQ зразків РНК має дуже високу кореляцію з ефективним обсягом даних.Для всіх зразків, які перевищують 0,2 нг/мкл FRQ, принаймні 70% зчитувань можуть ефективно покривати еталонну послідовність (рис. 4).

На малюнку 4 показано, що значення FRQ, визначене кількісним методом флуоресценції, має дуже високу кореляцію (R2>0,9) з ефективними даними, отриманими в експерименті NGS.Червона лінія – це значення FRQ, що дорівнює 0,2 нг/мкл (log10 = -0,7).【4】

Окрім застосування до зразків FFPE, метод кількісної ПЛР у реальному часі також може ефективно контролювати інгібітори у зразках.Ми можемо додати зразок для виявлення в реакційну систему за допомогою внутрішнього позитивного контролю (IPC) і його аналізу, а потім виконати кількісне визначення флуоресценції, щоб отримати значення Ct.Якщо значення Ct відстає від значення Ct у реакції без зразка, це означає, що інгібітор присутній у зразку та пригнічує ефективність ампліфікації в реакції.

05 Метод флуоресцентного барвника Qubit

Флуорометр Qubit — це найчастіше використовуваний невеликий пристрій для визначення концентрації та чистоти нуклеїнових кислот, який простий у експлуатації та є майже в кожній лабораторії молекулярної біології.Він точно розраховує концентрацію нуклеїнової кислоти шляхом виявлення та зв’язування нуклеїнової кислоти флуоресцентного барвника (реагент для виявлення Qubit).Qubit має високу чутливість і специфічність і може точно визначити кількість РНК аж до концентрації пг/мкл.На додаток до добре відомої здатності точного кількісного визначення концентрації нуклеїнової кислоти, остання нова модель Thermo Fisher, Qubit 4.0, також може виявляти цілісність РНК.Система виявлення РНК Qubit 4.0 (аналіз RNA IQ) виявляє цілісність РНК шляхом одночасного виявлення двох специфічних флуоресцентних барвників.Ці два флуоресцентні барвники можуть зв’язуватися з великими та малими фрагментами РНК відповідно.Ці два флуоресцентні барвники вказують на частку великих фрагментів РНК у зразку, і на основі цього можна розрахувати значення IQ (цілісності та якості), яке представляє якість РНК.Значення IQ застосовується як до зразків FFPE, так і до зразків без FFPE і має великий вплив на якість подальшого секвенування.Беручи як приклад експерименти NGS, у тестових експериментах RNA-Seq, проведених на платформі Ion torrent™, більшість зразків із значеннями IQ понад 4 мали принаймні 50% ефективних зчитувань (рис. 5).Порівняно з вищезгаданими методами виявлення Qubit IQ Assay не тільки зручніший у експлуатації та займає менше часу (протягом п’яти хвилин), але також має чудову кореляцію між виміряним значенням параметра IQ та якістю даних подальших експериментів.

На малюнку 5 існує велика кореляція між значенням Qubit RNA IQ і картованими зчитуваннями RNA-Seq.【5】

Завдяки наведеному вище вступу я вважаю, що кожен має достатнє розуміння різних методів контролю якості РНК.На практиці вибирати можнавідповідний метод відповідно до типу зразка та наявних інструментів.Лише добре контролюючи якість РНК, ми можемо уникнути провалу наступних експериментів, викликаного низькою якістю зразка, таким чином заощадивши дорогоцінний час, енергію та кошти.

Довідкова продукція:

Набір для виділення тотальної РНК тварин

Набір для виділення тотальної РНК клітини

посилання

【1】Шредер, А., Мюллер, О., Стокер, С. та ін.RIN: номер цілісності РНК для призначення значень цілісності вимірюванням РНК.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Посібник користувача Oncomine Human Immune Repertoire (публ. № MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived from Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, том 170, випуск 2, серпень 2019 р., сторінки 357 –373,https://doi.org/10.1093/toxsci/