Ми були досвідченим виробником.Здобувши більшість у вирішальних сертифікаціях свого ринку для високочутливого однокрокового датчика Rt-QpcrKit V2, Якість — це життя заводу, Орієнтація на попит клієнтів — джерело виживання та розвитку компанії, Ми дотримуємося принципів чесності та сумлінного ставлення до роботи, з нетерпінням чекаємо на ваш прихід!
Ми були досвідченим виробником.Отримавши більшість у важливих сертифікатах свого ринкуДНК-полімераза China Taq, Qpcr, Наша компанія обіцяє: розумні ціни, короткий термін виготовлення та задовільний післяпродажний сервіс, ми також запрошуємо вас відвідати наш завод у будь-який зручний для вас час.Бажаю тепер у нас приємних і тривалих спільних відносин!!!

Описи

У цьому наборі використовується унікальна буферна система лізису, яка може швидко вивільняти РНК із культивованих клітинних зразків для реакцій RT-qPCR, таким чином усуваючи трудомісткий і трудомісткий процес очищення РНК.Шаблон РНК можна отримати всього за 7 хвилин.Реагенти 5×Direct RT Mix і 2×Direct qPCR Mix-SYBR, що входять до комплекту, дозволяють швидко й ефективно отримувати кількісні результати ПЛР у реальному часі.

5×Direct RT Mix і 2×Direct qPCR Mix-SYBR мають сильну толерантність до інгібіторів, і лізат зразків можна використовувати як матрицю безпосередньо для RT-qPCR.Цей набір містить унікальну високоафінну РНК зворотну транскриптазу Foregene та ДНК-полімеразу Hot D-Taq, dNTP, MgCl₂, реакційний буфер, оптимізатор і стабілізатор ПЛР.

Технічні характеристики

200×20 мкл Rxns, 1000×20 мкл Rxns

Компоненти набору

Особливості та переваги

■ Простий і ефективний: за допомогою технології Cell Direct RT зразки РНК можна отримати всього за 7 хвилин.

■ Попит на вибірку невеликий, можна протестувати лише 10 клітин.

■ Висока продуктивність: він може швидко виявляти РНК у клітинах, культивованих у 384, 96, 24, 12, 6-лункових планшетах.

■ DNA Eraser може швидко видаляти звільнені геноми, значно зменшуючи вплив на наступні експериментальні результати.

■ Оптимізована система RT-PCR робить двоетапну зворотну транскрипцію RT-PCR більш ефективною, а ПЛР більш специфічною та стійкою до інгібіторів реакції RT-PCR.

Аплікація комплекту

Сфера застосування: культивовані клітини.

- РНК, вивільнена в результаті лізису зразка: застосовується лише до матриці RT-qPCR цього набору.

- Набір можна використовувати для наступних цілей: аналіз експресії генів, перевірка ефекту глушіння генів, опосередкованого siRNA, скринінг ліків тощо.

Діаграма

Зберігання та термін придатності

Частину I цього набору слід зберігати при 4 ℃;Частина II повинна зберігатися при -20 ℃.

Foregene Protease Plus II слід зберігати при 4 ℃, не заморожувати при -20 ℃.

Реагент 2×Direct qPCR Mix-SYBR слід зберігати при -20 ℃ у темряві;при частому використанні його також можна зберігати при 4 ℃ для короткочасного зберігання (використати протягом 10 днів). Ми були досвідченим виробником.Здобувши більшість у вирішальних сертифікаціях на своєму ринку за великими знижками, високочутливий одноступінчатий зонд Rt-Qpcr у Китаї V2, якість — це заводський термін служби, зосередженість на попиті клієнтів — джерело виживання та розвитку компанії, ми дотримуємося принципів чесності та добросовісності у роботі, з нетерпінням чекаємо на ваш прихід!
Велика знижкаДНК-полімераза China Taq, Qpcr, Наша компанія обіцяє: прийнятні ціни, короткий час виробництва та задовільний післяпродажний сервіс, ми також запрошуємо вас відвідати наш завод у будь-який зручний для вас час.Бажаю тепер у нас приємних і тривалих спільних відносин!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qПЛР Kit -Taqman

Кат.№DRT-01021/01022

Для клітинної прямої RT-qPCR з використанням ≤ 1000 000 клітин

Представлення продукту

У цьому продукті використовується унікальна буферна система лізису для швидкого вивільнення РНК із культивованих зразків клітин для реакцій RT-qPCR, усуваючи трудомісткий процес очищення РНК і лише 7 хвилин для отримання необхідної матриці РНК, завдяки суміші 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman, що надається в наборі, може швидко й ефективно отримати кількісні результати ПЛР у реальному часі.

5× Direct RT Mix і 2× Direct qPCR Mix-Taqman мають сильну толерантність до інгібіторів і можуть виконувати ефективну реверсію та специфічну ампліфікацію, використовуючи лізат зразка, який потрібно виміряти, як шаблон.Реагент містить зворотну транскриптазу Foregene, ДНК-полімеразу Hot D-Taq, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer, який можна використовувати з буфером лізису для швидкого та легкого виявлення зразків, і має характеристики високої чутливості, специфічності та стабільності.

Особливості продукту

Проста та ефективна технологія Cell Direct RT, яка займає всього 7 хвилин, щоб отримати зразки РНК.

Вимоги до зразків невеликі, і для експерименту можна використовувати щонайменше 10 культивованих клітин.

Висока продуктивність для швидкого отримання РНК культивованих клітин, таких як 384, 96, 24, 12 і 6-лункові планшети.

DNA Eraser здатний швидко видаляти звільнені геноми, значно зменшуючи вплив на наступні експериментальні результати.

Оптимізовані системи RT та qPCR забезпечують двоетапну RT-PCR із більш ефективною зворотною транскрипцією, специфічністю та більшою толерантністю до інгібіторів реакції RT-qPCR.

Аплікація комплекту

Сфера застосування: Культивовані клітини.

РНК, інтерпретована лізисом зразка: використовується лише як двоетапна матриця RT-qPCR.

Набори можна використовувати для таких цілей: аналіз експресії генів, тестування на алелі, скринінг ліків тощо.

Обмеження комплекту

Ампліфіковані фрагменти ≤ 300 bp.

Набори використовуються для свіжого культивування клітин.

Контроль якості продукції

Відповідно до Загальної системи управління якістю FOREGENE кожна партія наборів серії Cell Direct RT-qPCR проходить суворе багаторазове тестування, щоб забезпечити надійність і стабільність якості кожної партії наборів.

Вміст набору

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman можна придбати окремо, деталі наведено в Додатку 1 (СТОР. 13).

Умови зберігання

1. Умови доставки

Весь процес транспортування коробки з льодом при низькій температурі, щоб гарантувати, що набір знаходиться в стані <4 °C.

2. Умови зберігання

Зберігайте частину I при 4°C, а частину II при -20°C.

Foregene Protease Plus II слід зберігати при 4°C, не заморожувати при -20°C.

Реагент 2× Direct qPCR Mix-Taqman зберігається при -20°C або при 4°C для короткочасного використання, якщо його часто використовують (протягом 10 днів).

Інформація про компоненти набору

Буфер CL: забезпечує середовище, необхідне для реакцій лізису клітин.

Буфер ST: припиняє активну речовину в лізаті, щоб уникнути впливу на наступну RT.

DNA Eraser: засіб для видалення ДНК, вплив видалення геному на наступні експерименти.

5× Direct RT Mix: Містить Foregene Reverse Transcriptase з високою спорідненістю до РНК, інгібітор РНКази, dNTP, стабілізатори, підсилювачі, оптимізатори та праймери зворотної транскрипції для оптимального вирівнювання (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Буквар).

Foregene Protease Plus II: у контексті буфера лізису клітини лізуються для вивільнення нуклеїнових кислот.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: цей реагент містить гарячу ДНК-полімеразу D-Taq, dNTP, MgCl₂, реакційний буфер, ПЛР-оптимізатор і стабілізатор.

20× ROX Reference Dye: зазвичай використовується на інструментах ПЛР-ампліфікації в реальному часі ABI, Stratagene та інших компаній, він використовується для регулювання різниці між пробірками для ПЛР і пробірками, спричиненими помилками дозування ПЛР.Концентрація еталонного барвника ROX 20×, необхідна для різних інструментів, є різною, і користувач може додати його відповідно до рекомендованої концентрації інструменту.

ddH без РНКази₂O: Стерилізована надчиста вода без РНКаз для двоетапної реакції RT-qPCR.

Запобіжні заходи:(Обов'язково уважно прочитайте застереження перед використанням набору)

Зверніть увагу на метод проведення експерименту, щоб уникнути перехресного забруднення між зразками.

Зверніть увагу на чистоту експериментального середовища та посуду, щоб уникнути забруднення РНКазою та деградації РНК.

Візьміть свіжі або добре збережені зразки клітин і ніколи не використовуйте повторно заморожені-розморожені зразки клітин.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman слід уникати повторного заморожування-розморожування, інакше це вплине на зворотну транскрипцію та ефективність ПЛР.

Prepaпайкиранішеоперація

Обов'язково уважно прочитайте інструкцію перед використанням цього набору.Набір Cell Direct RT-qPCR простий, зручний і швидкий в експлуатації, а інструкції містять повну інформацію про весь набір і про те, як ним правильно користуватися.Перед використанням підготуйте необхідні експериментальні матеріали та обладнання.

Експериментальні матеріали та обладнання

◆ Культура клітин.

◆ 1,5 мл або 2 мл, центрифужна пробірка без РНКази/ДНКази, наконечник без РНКази/ДНКази, стерильна пробірка qPCR на 0,2 мл.

◆ КПЦР апарат, піпетка, настільна центрифуга (≥13 400×ж) (залежно від експериментальних потреб) тощо.

Безпека

◆ Цей продукт призначений лише для науково-дослідницьких цілей, будь ласка, не використовуйте його для фармацевтичних, клінічних, харчових і косметичних цілей.

◆ Під час використання хімікатів одягайте відповідний лабораторний одяг, рукавички, захисні окуляри тощо.

Операціянапрямні

Системи клітинного лізису, системи RT і пакети додаткових реакційних розчинів для КПЦР можна придбати окремо, деталі в Додатку 1 (СТОР. 13).

Керівництво по експлуатації

A: Вивільнення зразка РНК

1. Клітини були попередньо оброблені: промийте чашку для культури клітин холодним PBS, потім лізуйте клітини (10-10⁶), 10⁶ ніж кількість клітин, рекомендується Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) або Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) для виділення та очищення РНК.

1.1.Прикріплені клітини (24-лунковий планшет як приклад)

1.1.1.Визначте кількість клітин у кожній лунці, визначте, що кількість клітин дорівнює 1×10⁵, і за допомогою піпетки вийміть культуральне середовище з культуральної чашки.

1.1.2.Додайте 200 мкл попередньо охолодженого 1 × PBS до кожної лунки.Не піпетуйте повторно та видаляйте PBS з лунок.Нахиліть планшет і видаліть якомога більше PBS.Перейдіть до кроку 2.

1.1.3.Для промивання клітин до чашки для культури клітин додавали попередньо охолоджений 1 × PBS або номер таблиці 1-1 у чашці для культур клітин.

Таблиця 1-1: Дозування PBS для різної кількості клітин

Примітка:Щоб забезпечити міцне зчеплення клітин，уникнення втрати великої кількості клітин при пранні.

1.2.Суспензійні клітини або прикріплені клітини, культивовані в непористих чашках

1.2.1.Прикріплені клітини, культивовані в небагатолункових планшетах (суспензійні клітини починають з наступного кроку 1.2.2), збирають і відокремлюють клітини відповідно до звичайного методу збору клітин і поміщають їх у культуральний планшет або центрифужну пробірку;якщо використовується трипсинізація, потрібне центрифугування для збору клітин і видалення залишків трипсину, додавання PBS ресуспендованих клітин в окремі клітини для диспергування клітин.

1.2.2.Після підрахунку кількості клітин аликвоти клітин 1×10⁵ одну в пробірки для центрифугування, збирайте клітини центрифугуванням при 1000 × g протягом 10 хв.

1.2.3.Додайте 200 мкл PBS у центрифужну пробірку, не піпетуйте повторно, а безпосередньо аспіруйте PBS.перейдіть до кроку 2. (Якщо важко осадити і клітини знову ресуспендували, можна виконати центрифугування 1000 × g через 10 хвилин після видалення супернатанту, клітинний осад перейдіть до кроку 2)

2. Лізис клітин: видаліть буфер CL, його температуру врівноважте до кімнатної температури, DNA Eraser і Foregene Protease Plus II відповідно до наведеної нижче таблиці 1-2 підготовленої системи для лізису: (Розчин для лізису готовий до використання).

Таблиця 1-2: розщеплення системна підготовка (Примітка: при підготовці на льоду)

3. (24-лунковий планшет як приклад) Внесіть 200 мкл основної суміші для лізису клітин у кожну лунку, кілька разів продуйте 5-10 разів, інкубуйте при кімнатній температурі (20-25 ℃) протягом 5 хвилин.

Примітка:Щоб уникнути утворення бульбашок, будь ласка, під час піпетування шкалу піпетки відрегулюйте на 200 мкл або менше.Після лізису клітини можуть виглядати каламутними, що є нормальним явищем.

4. (24-лунковий планшет як приклад) додають у рідину 20 мкл буфера ST (буфер ST різних систем лізису додають у кількості, наведеній у таблиці 1-3), повторюють піпетування 5-10 разів при кімнатній температурі (20-25 ℃) інкубують протягом 2 хвилин.

Примітка:Наконечник піпетки розташований під поверхнею, забезпечуючи додавання лізату，щоб уникнути утворення бульбашок, під час піпетування шкалу піпетки було відрегульовано до 200 мкл або менше.

Таблиця 1-3:Додайте буфер ST

5. Лізат використовується для наступних експериментів RT-qPCR.Якщо наступні експерименти не можна провести вчасно, будь ласка, зберігайте його на льоду не більше 2 годин і зберігайте при -20 ℃ або -80 ℃ (не більше трьох місяців).

B: Підготовка системи RT

1. Вийміть 5 × суміші Direct RT і помістіть її на крижану баню, дайте їй розтанути природним чином і обережно перемішайте для подальшого використання;вийміть ddH2O без РНКази, розтопіть його та поставте на крижану баню для подальшого використання.Підготуйте реакційну систему на льоду відповідно до таблиці 2-1 нижче.

Таблиця 2-1: Приготування реакційної системи RT

2. Після завершення складання системи обережно перемішайте та коротко відцентрифугуйте в наведеній нижче таблиці 2-2 умови реакції RT реакція.

Таблиця 2-2: Налаштування умови реакції RT

3.Після завершення реакції продукт реакції помістили безпосередньо на лід для проведення кПЦР, будь ласка, помістіть довготривале зберігання -20 ℃ або -80 ℃.

Примітка: через використання неочищеного шаблону в продукті зворотної транскрипції можуть з’явитися білі осади.Це нормальне явище.Негайно відцентрифугуйте супернатант для подальших експериментів.

Отриманий реакційний розчин RT додають до реакційних систем ПЛР у реальному часі на наступному етапі, рекомендовано додавати кількість від 10 до 30% реакційної системи.

C: Підготовка реакційної системи кПЛР

1. Для приготування реакційної системи відповідну кількість B готують на етапі кДНК-матриці відповідно до наступної таблиці 3-1.

Примітка: кількість матриці кДНК становить 10-30% системи кПЦР.Наприклад, у систему qPCR на 20 мкл додайте 2-6 мкл буфера для лізису, але не більше 6 мкл.

2. Оптимальні умови qPCR (температура відпалу тощо) для реакції qPCR (умови реакції наведено в таблиці 3-2).

Примітка. Спробуйте використовувати оптимізовані умови для реакцій кПЦР, щоб отримати кращі результати.

Таблиця 3-1: Підготовка реакційної системи ПЛР

1*: Концентрацію праймера можна регулювати в діапазоні 50-900 нМ, якщо ефективність реакції праймера є поганою.

Примітка. Систему кПЛР можна налаштувати відповідно до експериментальних потреб і моделі циклера флуоресценції.Для КПЦР в 50μl системи, відрегулюйте дозування реагенту пропорційно відповідно до 20μl система.

2*: Виберіть відповідну кінцеву концентрацію еталонного барвника ROX відповідно до кількісного термоциклера флуоресценції.Найбільш прийнятні концентрації еталонного барвника ROX для звичайних кількісних циклерів флуоресценції наведено в таблиці нижче:

Таблиця 3-2: наведено умови реакції кПЛР

Примітка: щоб отримати найкращий ефект кПЦР, можна використовувати градієнтну ПЛР для оптимізації умов реакції для різних матриць і різних праймерів.Умови реакції ПЛР змінюються залежно від аналізатора флуоресценції, матриці, праймера тощо. У конкретній операції необхідно розробити оптимальні умови реакції відповідно до конкретних умов кількісного термоциклера флуоресценції, типу матриці, розміру цікавого фрагмента, послідовності основ ампліфікованого фрагмента та вмісту GC і довжини праймерів, включаючи температуру відпалу, час реакції тощо.

Принципи розробки праймерів ПЛР у реальному часі

Прямий і зворотний буквари

Для ПЛР у реальному часі дизайн праймера дуже важливий.Праймери пов’язані зі специфічністю та ефективністю ПЛР-ампліфікації та можуть бути розроблені з посиланням на такі принципи:

◆ Довжина грунтовки: 18-30 п.н.

◆ Вміст GC: 40-60%.

◆ Значення Tm: програмне забезпечення для розробки праймера, наприклад Primer 5, може надати значення Tm праймера.Значення Tm перших і наступних праймерів повинні бути якомога ближчими.Також можна використовувати формулу розрахунку Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Під час проведення ПЛР температуру нижче значення Tm праймера 5 °C зазвичай вибирають як температуру відпалу (відповідне підвищення температури відпалу може збільшити специфічність реакції ПЛР).

◆ Праймери та продукти ПЛР:

◆ Бажано, щоб довжина продукту ПЛР-ампліфікації становила 100-150 bp.

◆ Наскільки це можливо, слід уникати ґрунтовок для дизайну у вторинній структурній зоні шаблону.

◆ Уникайте утворення 2 або більше комплементарних основ між 3'-кінцями верхнього та нижнього за течією праймерів.

◆ Термінальна основа праймера 3′ не може бути присутня з 3 додатковими послідовними G або C.

◆ Праймери самі по собі не можуть мати комплементарних структур, інакше буде сформована шпилькова структура, що вплине на ПЛР-ампліфікацію.

◆ ATCG слід розподілити якомога рівномірніше в послідовності праймерів, і слід уникати 3' кінцевої основи, оскільки T.

Додаток1:Cell DirectRT-qPCR Компонент комплектуt пакет добавок

1. Розчин для лізису клітин