Стерилізація наконечників піпеток і пробірок EP тощо.
1. Приготуйте 0,1% (одна тисячна) DEPC (високотоксична речовина) з деіонізованою водою, обережно використовуйте його у витяжній шафі та зберігайте при температурі 4°C подалі від світла;
Вода DEPC - це чиста вода, оброблена DEPC і стерилізована високою температурою та високим тиском.Перевірено на відсутність РНКази, ДНКази та протеїнази.
2. Помістіть наконечник піпетки та трубку EP у 0,1% DEPC і переконайтеся, що наконечник піпетки та трубка EP заповнені 0,1% DEP.
3. Захищайте від світла, залиште на ніч (12-24 години)
4. Коробку з наконечником і трубкою EP не потрібно змочувати в DEPC.Після грубого видалення DEPC-води з наконечника або EP-пробірки запакуйте його та загорніть.
5. 121 градус Цельсія, 30 хв
6. 180 градусів за Цельсієм, сушити кілька годин (не менше 3 годин)
Примітка: a.Одягайте латексні рукавички та маски при роботі з DEPC!b, або без DEPC стерилізації, 130 ℃, 90 хв автоклав (у багатьох лабораторіях високотемпературна стерилізація двічі)
Міркування щодо виділення РНК
Два основних явища невдачі ізоляції тканинної РНК
Деградація РНК і залишки домішок у тканинах,Що стосується деградації, давайте спочатку подивимося, чому РНК, екстрагована з культивованих клітин, не легко розкладається.Всі існуючі реагенти для екстракції РНК містять компоненти, які швидко пригнічують РНКазу.Додайте лізат до культивованих клітин і просто перемішайте, усі клітини можна буде ретельно змішати з лізатом, і клітини будуть повністю лізовані.Після лізису клітин активні інгредієнти лізату негайно пригнічують внутрішньоклітинну РНКазу, тому РНК залишається неушкодженою.Тобто, оскільки культивовані клітини легко і повністю контактують з лізатом, їх РНК нелегко деградує;з іншого боку, РНК у тканині легко розкладається, оскільки клітинам у тканині непросто швидко зв’язатися з лізатом.завдяки достатньому контакту.Так,якщо припустити, що існує спосіб перетворити тканину на одну клітину, одночасно пригнічуючи активність РНК, проблема деградації може бути повністю вирішена.
Найефективнішим таким методом є розмелювання рідким азотом.Однак метод помелу рідкого азоту є дуже складним, особливо коли кількість зразків велика.Це дало початок наступній найкращій речі: гомогенізатору.TheгомогенізаторМетод не розглядає питання про те, як активність РНКази пригнічується до того, як клітини контактують з лізатом, а радше молиться, щоб швидкість руйнування тканини була швидшою, ніж швидкість, з якою внутрішньоклітинна РНКаза руйнує РН.
Ефект електричного гомогенізатора кращий,і ефект скляного гомогенізатора поганий, але в цілому метод гомогенізатора не може запобігти явищу деградації.Тому, якщо екстракція погіршується, слід використовувати оригінальний електричний гомогенізатор для подрібнення рідким азотом;оригінальний скляний гомогенізатор слід замінити на електричний гомогенізатор або безпосередньо подрібнити рідким азотом.Проблема здійсненна майже на 100%.отримати вирішення.
Проблема залишків домішок, що впливає на наступні експерименти, має більше різноманітних причин, ніж деградація, і рішення, відповідно, різні.На закінчення,якщо є деградація або залишкові домішки в тканині, необхідно оптимізувати метод екстракції/реагент для конкретного експериментального матеріалу.Вам не обов’язково використовувати ваші дорогоцінні зразки для оптимізації: ви можете купити на ринку дрібних тварин, наприклад рибу/курку, взяти відповідну частину матеріалу для екстракції РНК, а іншу частину – для екстракції білка – подрібнити з екстрактом рота, шлунка та кишечника.
Цільова РНК екстрагованої РНК використовується для різних подальших експериментів, і вимоги до її якості різні
конструкція бібліотеки кДНК вимагає цілісності РНК без залишків інгібіторів ферментних реакцій;Northern вимагає вищої цілісності РНК і нижчих вимог до залишків інгібіторів ферментних реакцій;RT-PCR не вимагає занадто високої цілісності РНК,але пригнічує ферментні реакції.Вимоги щодо залишків суворі.Вхід визначає вихід;кожного разу, коли метою є отримання РНК найвищої чистоти, це коштуватиме людям і грошей.
Збір/зберігання зразків
Фактори, що впливають на деградацію Після того, як зразок покине живе тіло/або початкове середовище росту, ендогенні ферменти в зразку почнуть розкладати РНК,швидкість розпаду залежить від вмісту ендогенних ферментів і температури.Традиційно існує лише два способи повністю інгібувати активність ендогенного ферменту: негайно додати лізат і ретельно та швидко гомогенізувати;нарізати на дрібні шматочки і негайно заморозити в рідкому азоті.Обидва підходи вимагають швидкої роботи.Останній підходить для всіх зразків, тоді як перший підходить лише для тканин з низьким вмістом клітин та ендогенних ферментів і легше гомогенізується.Зокрема, рослинну тканину, печінку, вилочкову залозу, підшлункову залозу, селезінку, мозок, жир, м’язову тканину тощо найкраще заморозити рідким азотом перед тим, як продовжити.
Фрагментація та гомогенізація проб
Фактори, що впливають на деградацію та врожайність Фрагментація зразкадля повної гомогенізації, який призначений для повного та повного вивільнення РНК.Клітини можна безпосередньо гомогенізувати, не розбиваючи.Тканини можуть бути гомогенізовані лише після розламування.Дріжджі та бактерії необхідно розщепити відповідними ферментами, перш ніж їх можна буде гомогенізувати.Тканини з нижчим вмістом ендогенного ферменту та легшою гомогенізацією можуть бути подрібнені та гомогенізовані за один раз у лізаті за допомогою гомогенізатора;рослинна тканина, печінка, тимус, підшлункова залоза, селезінка, мозок, жирова тканина, м’язова тканина та інші зразки. Вони або містять високий вміст ендогенних ферментів, або їх важко гомогенізувати,тому руйнування тканин і гомогенізація повинні виконуватися окремо.Найнадійнішим і найпродуктивнішим способом дроблення є подрібнення рідким азотом, а найбільш надійним способом гомогенізації є використання електричного гомогенізатора.Особлива примітка щодо помелу рідким азотом: зразок не можна розморожувати протягом усього процесу помелу, оскільки ендогенні ферменти, швидше за все, функціонуватимуть у замороженому стані.
Вибір лізату
Впливають на зручність експлуатації та фактори залишкових ендогенних домішок Зазвичай використовувані розчини для лізису можуть майже пригнічувати активність РНКази.Тому ключовим моментом вибору розчину для лізису є розгляд у поєднанні з методом очищення.Є один виняток:Для зразків з високим вмістом ендогенних ферментів рекомендується використовувати лізат, що містить фенол, щоб збільшити здатність інактивувати ендогенні ферменти.
Вибір методу очищення
Фактори, що впливають на залишкові ендогенні домішки, швидкість екстракції. Для чистих зразків, таких як клітини, можна отримати задовільні результати майже будь-яким доступним методом очищення.Але для багатьох інших зразків, особливо тих, що мають високий рівень домішок, таких як рослини, печінка, бактерії тощо, вибір відповідного методу очищення є вирішальним.Метод відцентрового очищення колонки має високу швидкість екстракції та може ефективно видаляти домішки, які впливають на подальшу ферментативну реакцію РНК, але він дорогий (Foregene може запропонувати економічно ефективні набори, докладніше клацнітьтут);використання економічних і класичних методів очищення, таких як осадження LiCl, також може отримати задовільні результати, але час роботи тривалий..
«Три дисципліни і вісім уваги» для екстракції РНК
Дисципліна 1:Покласти край забрудненню екзогенних ферментів.
Примітка 1:Строго носити маски та рукавички.
Примітка 2:Центрифужні пробірки, головки наконечників, стрижні піпеток, резервуари для електрофорезу та експериментальні столи, задіяні в експерименті, повинні бути ретельно утилізовані.
Примітка 3:Реагенти/розчини, задіяні в експерименті, особливо вода, не повинні містити РНКази.
Дисципліна 2:Блокують активність ендогенних ферментів
Примітка 4:Виберіть відповідний метод гомогенізації.
Примітка 5:Виберіть відповідний лізат.
Примітка 6:Контролюйте вихідну кількість зразка.
Дисципліна 3:Уточніть мету видобутку
Примітка 7:Коли будь-яка система лізату наближається до максимальної початкової кількості зразка, рівень успіху екстракції різко падає.
Примітка 8:Єдиним економічним критерієм успішної екстракції РНК є успіх у наступних експериментах, а не вихід.
Топ-10 джерел зараження РНКазами
1. Пальці є першим джерелом екзогенних ферментів, тому рукавички потрібно надягати та часто міняти.Крім того, необхідно носити маски, адже дихання також є важливим джерелом ферментів.Додатковою перевагою носіння маски-рукавички є захист експериментатора.
2. Наконечники піпеток, центрифужні пробірки, піпетки – РНКазу неможливо інактивувати лише стерилізацією, тому наконечники піпеток і центрифужні пробірки слід обробляти DEPC, навіть якщо вони позначені як оброблені DEPC.Найкраще використовувати спеціальну піпетку, протирати її перед використанням ватним диском 75% спирту, особливо стрижень;крім того, не використовуйте засіб для видалення головок.
3. Вода/буфер має бути вільним від забруднення РНКазою.
4. Принаймні тестовий стіл слід протерти ватними кульками, розчиненими на 75 % спирту.
5. Ендогенна РНКаза. Усі тканини містять ендогенні ферменти, тому швидке заморожування тканин рідким азотом є найкращим способом зменшити деградацію.Метод зберігання/подрібнення в рідкому азоті справді незручний, але це єдиний спосіб для тканин з високим рівнем ендогенних ферментів.
6. Зразки РНК Продукти екстракції РНК можуть містити сліди забруднення РНКазою.
7. Екстракція плазміди. Екстракція плазміди часто використовує Рназу для деградації РНК, а залишкову Рназу слід розщепити протеїназою К і екстрагувати за допомогою ЧКВ.
8. Зберігання РНК. Навіть якщо вона зберігається при низькій температурі, слідові кількості РНКази призведуть до деградації РНК.Найкращим рішенням для тривалого збереження РНК є сольово-спиртова суспензія, оскільки спирт пригнічує всю ферментативну активність при низьких температурах.
9. Коли катіони (Ca, Mg) містять ці іони, нагрівання при 80°C протягом 5 хвилин призведе до розщеплення РНК, тому, якщо потрібно нагріти РНК, консервуючий розчин повинен містити хелатуючий агент (1мМ цитрат натрію, pH 6,4).
10. Ферменти, використані в наступних експериментах, можуть бути забруднені РНКазою.
10 порад щодо екстракції РНК
1: Швидке запобігання активності РНКази.Зразки швидко заморожують після збору, і РНКаза інактивується швидкою операцією під час лізису.
2: Виберіть відповідний метод екстракції для тканини з високим вмістом рибозиму, а для жирової тканини найкраще використовувати метод, що містить фенол.
3: Якість передбачення вимагає Northern, побудова бібліотеки кДНК вимагає високої цілісності, а RT-PCR і RPA (аналіз захисту рибонуклеази) не вимагають високої цілісності.RT-PCR вимагає високої чистоти (залишки інгібітора ферменту).
4: Ретельна гомогенізація є ключем до підвищення врожайності та зменшення деградації.
5: Перевірте цілісність виявлення електрофорезу РНК, 28S: 18S = 2:1 є повною ознакою, 1:1 також прийнятно для більшості експериментів.
6: Видалення ДНК для RT-PCR, аналіз масиву Для видалення ДНК найкраще використовувати Dnase I.
7: Зменшити забруднення екзогенними ферментами – ферменти не можуть бути імпортовані ззовні.
8: При концентруванні нуклеїнової кислоти низької концентрації слід додати реагент для спільного осадження.Але щоб запобігти забрудненню копреципітанта, що містить ферменти та ДНК.
9: Ретельно розчиніть РНК, якщо необхідно, нагрійте при 65°C протягом 5 хвилин.
відповідний спосіб зберігання
Короткочасно може зберігатися при –20С, а тривалий – при –80С.Першим кроком у покращенні виходу РНК є усвідомлення того, що вміст РНК у різних зразках сильно відрізняється.Високий вміст (2-4 мкг/мг), такий як печінка, підшлункова залоза, серце, середній вміст (0,05-2 мкг/мг), такий як мозок, ембріон, нирки, легені, тимус, яєчники, низький вміст (<0,05 мкг/мг) мг), такий як сечовий міхур, кістки, жир.
1: лізуйте клітини для вивільнення РН – якщо РНК не вивільняється, вихід буде зменшено.Електрична гомогенізація працює краще, ніж інші методи гомогенізації, але її також може знадобитися поєднувати з іншими методами, такими як затирання рідким азотом, ферментативне розщеплення (лізоцим/літиказа)
2: Оптимізація методу вилучення.Найбільшими проблемами методів на основі фенолу є неповна стратифікація та часткова втрата РНК (надосадову рідину неможливо повністю видалити).Неповна стратифікація пов’язана з високим вмістом нуклеїнової кислоти та білка, що можна вирішити шляхом збільшення кількості використовуваного лізату або зменшення кількості зразка.До жирової тканини додавали стадію екстракції хлороформом.Втрату РНК можна зменшити зворотним відкачуванням або видаленням органічного шару з наступним центрифугуванням.Найбільшою проблемою методів колонкового центрифугування є надлишок зразка.
Класичні поради щодо вилучення
1. Очищення фенолу: додайте рівний об’єм фенолу/хлороформу 1:1 та енергійно перемішуйте протягом 1-2 хвилин.Центрифугувати на високій швидкості протягом 2 хвилин.Обережно видаліть супернатант (80-90%).Ніколи не добирайтеся до середнього шару.Рівний об’єм реакційного розчину можна додати до фенолу/хлороформу та видалити супернатант.Дві супернатанти можна змішати разом для осадження нуклеїнової кислоти для підвищення виходу.Не будьте надто обережними під час змішування та не намагайтеся видалити весь супернатант.
2. Промивання 70-80% етанолом: під час промивання нуклеїнову кислоту необхідно суспендувати, щоб переконатися, що залишки солі вимито.У той же час відразу після зливання етанолу відцентрифугуйте на високій швидкості протягом декількох секунд, а потім піпеткою видаліть залишки етанолу.Розчинити після відстоювання при кімнатній температурі протягом 5-10 хвилин.
11. Видобуток спеціальних організацій
1. Фіброзна тканина: ключем до вилучення РНК із фіброзної тканини, такої як серце/скелетний м’яз, є повне руйнування тканини.Ці тканини мають низьку щільність клітин, тому кількість РНК на одиницю ваги тканини низька, і найкраще використовувати якомога більшу вихідну кількість.Обов’язково ретельно подрібніть тканину в умовах заморожування.
2. Тканини з високим вмістом білка/жиру: високий вміст мозку/рослинного жиру.Після екстракції PCI супернатант містить білі флокули.Супернатант необхідно повторно екстрагувати хлороформом.
3. Тканини з високим вмістом нуклеїнової кислоти/рибозиму: селезінка/тимус має високий вміст нуклеїнової кислоти та рибозиму.Подрібнення тканини в умовах заморожування з наступною швидкою гомогенізацією може ефективно інактивувати рибозими.Однак, якщо лізат занадто в’язкий (через високий вміст нуклеїнової кислоти), PCI-екстракція не зможе ефективно стратифікувати;додавання більшої кількості лізату може вирішити цю проблему.Кілька екстракцій PCI можуть видалити більше залишків ДНК.Якщо відразу після додавання спирту утворюється білий осад, це свідчить про забруднення ДНК.Повторна екстракція кислим PCI після розчинення може видалити забруднення ДНК.
4. Рослинна тканина: рослинна тканина складніша, ніж тваринна.Як правило, рослини подрібнюють в умовах рідкого азоту, тому деградація РНК ендогенними ферментами є незвичною.Якщо проблема деградації не вирішена, це майже напевно спричинено домішками, що містяться у зразку.Домішки, які містяться в багатьох рослинах, призводять до залишків, і причиною залишків часто є те, що ці домішки мають певну схожість з РНК: ви осідаєте, і я осідаю, і ви адсорбуєте, і я адсорбую.Ці характеристики визначають те, що вони є дуже сильними інгібіторами ферментів.
В даний час комерційні реагенти для екстракції РНК можуть бути адаптовані майже до всіх тканин тварин з невеликими коригуваннями, але існує кілька комерційних реагентів для екстракції РНК, які можуть бути придатними для більшості рослинних тканин.На щастя, Foregene може надати спеціальнінабори для екстракції РНК рослин, ми маємоНабір для виділення тотальної РНК рослин, Набір для виділення тотальної РНК рослин Plus.Останній розроблений спеціально для рослин з високим вмістом полісахаридів і поліфенолів.Для екстракції РНК відгуки користувачів лабораторії особливо хороші.
12. Вплив заморожування та розморожування зразка. Заморожений зразок може бути більшим, і його потрібно розрізати перед використанням для виділення РНК.Зразки мають тенденцію плавитися (можливо, частково) під час різання.Заморожені зразки може знадобитися зважити перед екстракцією РНК, і розморожування обов’язково відбудеться під час цього процесу.Іноді розморожування зразка також відбувається під час процесу помелу рідкого азоту;або заморожений зразок безпосередньо додається до лізату без помелу рідкого азоту, і розморожування обов’язково відбудеться до повної гомогенізації.Експерименти показали, що заморожена тканина більш схильна до деградації РНК під час розморожування, ніж свіжа тканина.Ймовірна причина: процес заморожування-відтавання порушує структури всередині клітини, полегшуючи ендогенним ферментам вступати в прямий контакт з РНК.
13. Оцінка якості РНК. Зазвичай електрофорез використовують для оцінки цілісності РНК, а A260/A280 використовують для оцінки чистоти РНК.Теоретично інтактна РНК має співвідношення 28S:18S = 2,7:1, і більшість даних підкреслюють співвідношення 28S:18S = 2:1.Справа в тому, що практично жодна РНК, витягнута з інших зразків, крім клітин, не має співвідношення 2:1 (це було отримано за допомогою біоаналізатора Agilent).
На результати електрофорезу РНК впливає багато факторів, включаючи вторинну структуру, умови електрофорезу, завантаження зразка, ступінь насичення EB тощо. Використовуйте нативний електрофорез для виявлення РНК і використовуйте маркер ДНК як контроль.Якщо 28S на 2kb і 18S на 0,9kb чіткі, а 28S: 18S > 1, цілісність може відповідати вимогам більшості наступних експериментів.
A260/A280 — індикатор, який викликав багато плутанини.Перш за все, необхідно уточнити первісне значення цього показника для нуклеїнових кислот: чиста РНК, її А260/280 = близько 2,0.Чиста РНК є «причиною», а A260/A280 = 2 є «наслідком».Зараз усі використовують A260/A280 як «причину», думаючи, що «якщо A260/A280 = 2, то РНК чиста», що, природно, призводить до плутанини.
Якщо ви зацікавлені, ви можете додати трохи реагенту, який часто використовується для екстракції, наприклад фенол, гуанідинізотіоціанат, PEG тощо, до вашого зразка РНК, а потім виміряти співвідношення A260/A280.Реальність така, що багато реагентів, які використовуються для екстракції РНК, а також багато домішок у зразку поглинають A260 і A280, впливаючи на A260/A280.
Найбільш повчальним підходом на даний момент є сканування зразків РНК в діапазоні 200-300 нм.Крива чистої РНК має такі характеристики: крива гладка, A230 і A260 є двома точками перегину, A300 близька до 0, A260/A280 = близько 2,0 і A260/A230 = близько 2,0.Якщо дані сканування недоступні, слід також визначити співвідношення A260/A230, оскільки це співвідношення більш чутливе до переносу всіх домішок, які впливають на ферментативну реакцію.Враховуйте лінійний діапазон приладу (0,1–0,5 для А260).
Є два інших корисних явища: співвідношення буде приблизно на 0,3 нижче, коли A260/A280 вимірюється у воді;в той час як співвідношення, виміряне в 10 мМ EDTA, приблизно на 0,2 вище, ніж виміряне в 1 мМ EDTA.
Супутні товари:
Серія ізоляції РНК Постачальники та фабрика |Виробники серії ізоляції РНК у Китаї (foreivd.com)
Серія виділення РНК – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Час публікації: 15 липня 2022 р
