Основа дизайну грунтовки (99% проблем можна вирішити)
1. Довжина букваря: для підручника потрібно 15-30 bp, зазвичай близько 20 bp.Фактичний стан краще становити 18-24 bp, щоб забезпечити специфічність, але чим довше, тим краще, занадто довгий праймер також зменшить специфічність і зменшить вихід.
2. Діапазон ампліфікації праймера: доречно 200-500 bp, і фрагмент можна розширити до 10 kb за певних умов.
3. Основа праймера: вміст G+C має становити 40-60%, занадто низький ефект посилення G+C не є хорошим, занадто багато G+C може легко з’явити неспецифічні смуги.ATGC найкраще розподіляти випадковим чином, уникаючи кластерів з більш ніж 5 пуринових або піримідинових нуклеотидів.Мульти-gc для 5'-кінця та проміжних послідовностей для підвищення стабільності, уникайте багатого GC на 3'-кінці, відсутність GC для останніх 3 основ або відсутність GC для 3 з останніх 5 основ.
4. Уникайте вторинної структури в праймерах і уникайте комплементації між двома праймерами, особливо комплементації на 3'-кінці, інакше буде сформований димер праймера та неспецифічні ампліфіковані смуги.
5. Основи на 3'-кінці праймерів, особливо остання та передостання основи, повинні бути строго попарними, щоб уникнути невдачі ПЛР через неспарені кінцеві основи.
6. Праймери мають або можуть бути додані з відповідними сайтами розщеплення, а ампліфікована цільова послідовність переважно повинна мати відповідні сайти розщеплення, що є дуже корисним для аналізу розщеплення або молекулярного клонування.
7. Специфічність праймерів: праймери не повинні мати очевидної гомології з іншими послідовностями в базі даних послідовностей нуклеїнових кислот.
8. Навчіться користуватися програмним забезпеченням: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (цей онлайн-дизайн працює найкраще).
Наведений вище вміст може вирішити принаймні 99% проблем дизайну грунтовки.
Контроль деталей оформлення грунтовки
1. Довжина грунтовки
Загальна довжина праймера становить 18~30 основ.Загалом, найважливішим фактором, що визначає температуру відпалу праймера, є довжина праймера.Зазвичай вибирається температура відпалу праймера (значення Tm -5 ℃), а деякі безпосередньо використовують значення Tm.Для приблизного розрахунку температури відпалу праймерів можна використовувати наступні формули.
Якщо довжина праймера менше 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Якщо довжина праймера перевищує 20 bp: 62,3 ℃+0,41 ℃ (%GC)-500/довжина-5 ℃
Крім того, багато програмного забезпечення також можна використовувати для розрахунку температури відпалу, принцип розрахунку буде іншим, тому іноді обчислене значення може мати невеликий розрив.Для оптимізації реакцій ПЛР використовуються найкоротші праймери, які забезпечують температуру відпалу не нижче 54 ℃ для найкращої ефективності та специфічності.
Загалом специфічність праймера збільшується в чотири рази для кожного додаткового нуклеотиду, тому мінімальна довжина праймера для більшості застосувань становить 18 нуклеотидів.Верхня межа довжини праймера не дуже важлива, головним чином пов'язана з ефективністю реакції.Через ентропію, чим довший праймер, тим нижча швидкість, з якою він відпалюється, щоб зв’язатися з цільовою ДНК, утворюючи стабільну дволанцюгову матрицю для зв’язування ДНК-полімерази.
При використанні програмного забезпечення для розробки праймерів довжину праймерів можна почергово визначити за значенням TM, особливо для праймерів флуоресцентної кількісної ПЛР, TM=60℃ або близько того слід контролювати.
2.Вміст GC
Як правило, вміст G+C у послідовностях праймерів становить 40%~60%, а вміст GC і значення Tm пари праймерів повинні бути узгоджені.Якщо праймер має серйозну тенденцію до GC або AT, до 5'-кінця праймера можна додати відповідну кількість хвоста A, T або G і C.
3. Температура відпалу
Температура відпалу повинна бути на 5 ℃ нижчою за температуру розчеплення.Якщо кількість основ праймера невелика, температуру відпалу можна підвищити відповідним чином, що може збільшити специфічність ПЛР.Якщо кількість основ є великою, температуру відпалу можна відповідно знизити.Різниця температур відпалу між парою праймерів у 4 ℃ ~ 6 ℃ не вплине на вихід ПЛР, але в ідеалі температура відпалу пари праймерів є однаковою, яка може коливатися від 55 ℃ до 75 ℃.
4. Уникайте вторинної структури шаблону ампліфікації
Найкраще уникати області вторинної структури шаблону під час вибору ампліфікованого фрагмента.Стабільну вторинну структуру цільового фрагмента можна передбачити та оцінити за допомогою відповідного комп’ютерного програмного забезпечення, що корисно для вибору шаблону.Експериментальні результати показують, що розширення часто є невдалим, коли вільна енергія (△G) області, яка має бути розширена, становить менше 58,6 кДж/моль.
5. Невідповідність з цільовою ДНК
Коли ампліфікована послідовність цільової ДНК є великою, праймер може зв’язуватися з кількома частинами цільової ДНК, що призводить до появи кількох смуг у результаті.Цього разу необхідно скористатися програмним тестуванням BLAST, сайт:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Виберіть Вирівняти дві послідовності (bl2seq).
Вставлення праймерних послідовностей у зону 1 і цільових послідовностей ДНК у зону 2 є взаємозамінними, і BLAST обчислює комплементарні, антисмислові та інші можливості, тому користувачам не потрібно помічати, чи є обидва ланцюги сенсовими.Ви також можете ввести номер GI, якщо знаєте номер GI послідовності в базі даних, тож вам не доведеться вставляти велику частину послідовності.Нарешті, клацніть «Вирівняти за 3», щоб побачити, чи має праймер кілька гомологічних сайтів у цільовій ДНК.
6. Грунтовка
3' кінець праймера - це місце, де починається розширення, тому важливо запобігти невідповідності починатися там.3 'кінець не повинен бути більше ніж 3 послідовних G або C, оскільки це призведе до помилкового запуску праймера в області послідовності збагачення G+C.3'-кінець не може утворювати жодної вторинної структури, за винятком спеціальних реакцій ПЛР (AS-PCR), 3'-кінець праймера не може бути невідповідним.Наприклад, якщо ділянка кодування ампліфікована, 3'-кінець праймера не повинен завершуватися в третій позиції кодону, оскільки третя позиція кодону схильна до дегенерації, що вплине на специфічність і ефективність ампліфікації.Використовуючи праймери анексії, зверніться до таблиці використання кодонів, зверніть увагу на біологічні переваги, не використовуйте праймери анексії на 3'-кінці та використовуйте вищу концентрацію праймерів (1uM-3uM).
7. Вторинна структура праймерів
Самі праймери не повинні мати комплементарних послідовностей, інакше самі праймери згортатимуться в шпилькові структури, і ця вторинна структура впливатиме на зв’язування праймерів і шаблонів через стеричні перешкоди.Якщо використовується штучне судження, безперервні комплементарні основи самих праймерів не повинні перевищувати 3 bp.Між двома праймерами не повинно бути комплементарності, особливо слід уникати комплементарного перекривання 3'-кінця, щоб запобігти утворенню димерів праймерів.Загалом, між парою праймерів має бути не більше 4 послідовних основ гомології або комплементарності.
8. Додайте маркери або локуси
5'-кінець мало впливає на специфічність ампліфікації і тому може бути змінений без впливу на специфічність ампліфікації.Модифікація праймера 5' кінця включала: додавання сайту рестрикції ферменту;Мічений біотин, флуоресценція, дигоксин, Eu3+ тощо. Введіть послідовності ДНК, що зв’язують білок;Введення сайтів мутації, вставка та відсутність послідовностей мутації та введення промоторних послідовностей тощо. Додаткові основи більшою чи меншою мірою вплинуть на ефективність ампліфікації та збільшать шанс утворення димеру праймера, але для наступного кроку потрібно зробити деякі поступки.Додаткові послідовності, які не існують у цільовій послідовності, такі як сайти рестрикції та промоторні послідовності, можна додати до 5'-кінця праймера без впливу на специфічність.Ці послідовності не включаються в обчислення значень Tm праймера, але їх слід протестувати на комплементарність і внутрішню вторинну структуру.
9. Субклони
У більшості випадків ПЛР – це лише попереднє клонування, а потім нам потрібно субклонувати цільовий фрагмент у різні вектори, тому нам потрібно розробити додаткові основи для наступної операції на етапі ПЛР.
Деякі послідовності, призначені для субклонування, підсумовані нижче.
Додано сайт рестрикції ендонуклеази рестрикції
Додавання сайтів рестрикції ферментів є найбільш часто використовуваним методом для субклонування продуктів ПЛР.Як правило, сайт розщеплення складається з шести основ, на додаток до 5 'кінця сайту розщеплення потрібно додати 2 ~ 3 захисні основи.Однак кількість захисних основ, необхідних для різних ферментів, різна.Наприклад, для SalⅠ не потрібна захисна основа, EcoRⅤ вимагає 1 захисна основа, NotⅠ вимагає 2 захисні основи, а Hind Ⅲ вимагає 3 захисні основи.
LIC додає хвіст
Повна назва LIC — клонування, незалежне від лігування, метод клонування, винайдений Navogen спеціально для його частини вектора pET.Носій pET, отриманий методом LIC, має некомплементарні 12-15 одноланцюгових липких кінців, які доповнюють відповідні липкі кінці цільового фрагмента вставки.Для цілей ампліфікації послідовність праймера 5' вставленого фрагмента повинна доповнювати вектор LIC.Екстранектна активність 3′→5′ ДНК-полімерази Т4 може утворити одноланцюговий липкий кінець на вставленому фрагменті через короткий час.Оскільки продукт може бути сформований лише шляхом взаємного відпалу підготовленого фрагмента вставки та вектора, цей метод є дуже швидким та ефективним і є спрямованим клонуванням.
Спрямований клон TA додає хвіст
Клонування ТА не змогло націлити фрагмент у вектор, тому пізніше компанія Invitrogen представила вектор, який міг націлити клонування, який містив чотири помітні основи GTGGS на одному кінці.Таким чином, у дизайні ПЛР-праймерів слід відповідним чином додавати комплементарні послідовності, щоб можна було «орієнтувати» фрагменти.
Якщо у вас мало часу, ви можете спробувати прямий синтез, поєднавши ген із вектором, що ми називаємо синтезом гена ET у музеологів.
D. Метод клонування In-Fusion
Не потрібна лігаза, не потрібна тривала реакція.Поки послідовність на обох кінцях лінеаризованого вектора введена в дизайн праймерів, потім продукт ПЛР і лінеаризований вектор додають у інфузійний ферментний розчин, що містить BSA, і поміщають при кімнатній температурі на півгодини, трансформація може бути виконана.Цей метод особливо підходить для перетворення великих обсягів.
10. Буквар злиття
Іноді про дизайн праймера відомо лише обмежену інформацію про послідовність.Наприклад, якщо відома лише послідовність амінокислот, можна сконструювати праймер злиття.Праймер злиття — це суміш різних послідовностей, що представляють усі різні можливості основ, які кодують одну амінокислоту.Щоб підвищити специфічність, ви можете звернутися до таблиці використання кодонів, щоб зменшити анексію відповідно до переваг базового використання різних організмів.Гіпоксантин можна поєднувати з усіма основами для зниження температури відпалу праймера.Не використовуйте додані основи на 3'-кінці праймера, тому що відпалу останніх 3 основ на 3'-кінці достатньо для початку ПЛР на неправильному місці.Використовуються вищі концентрації праймерів (від 1 мкМ до 3 мкМ), оскільки праймери в багатьох сумішах для приєднання не є специфічними для цільової матриці.
ПЛР сировинаКОНТРОЛЬ
1. Кількість праймера
Концентрація кожного праймера становить 0,1 ~ 1 мкмоль або 10 ~ 100 пмоль.Потрібний результат краще отримати з найменшою кількістю праймера.Висока концентрація праймера спричинить невідповідність і неспецифічну ампліфікацію, а також збільшить ймовірність утворення димерів між праймерами.
2. Концентрація грунтовки
Концентрація праймерів впливає на специфічність.Оптимальна концентрація праймера зазвичай становить від 0,1 до 0,5 мкМ.Вищі концентрації праймерів призводять до ампліфікації неспецифічних продуктів.
3. Температура відпалу праймера
Іншим важливим параметром для праймерів є температура плавлення (Tm).Це температура, коли 50% праймерів і комплементарних послідовностей представлені у вигляді дволанцюгових молекул ДНК.Tm необхідний для встановлення температури відпалу ПЛР.В ідеалі температура відпалу є достатньо низькою для забезпечення ефективного відпалу праймерів із цільовою послідовністю, але достатньо високою для зменшення неспецифічного зв’язування.Розумна температура відпалу від 55 ℃ до 70 ℃.Температура відпалу, як правило, встановлюється на 5 ℃ нижче, ніж Tm праймера.
Існує кілька формул для встановлення Tm, які значно відрізняються залежно від використовуваної формули та послідовності праймерів.Оскільки більшість формул надають приблизне значення Tm, усі температури відпалу є лише початковою точкою.Специфічність можна покращити шляхом аналізу кількох реакцій, які поступово підвищують температуру відпалу.Почніть з нижче оціненої Tm-5 ℃ і поступово збільшуйте температуру відпалу з кроком 2 ℃.Більш висока температура відпалу зменшить утворення димерів праймера та неспецифічних продуктів.Для отримання найкращих результатів два праймери повинні мати приблизні значення Tm.Якщо різниця Tm пар праймерів перевищує 5 ℃, праймери демонструватимуть значний помилковий старт через використання нижчої температури відпалу в циклі.Якщо Tm двох праймерів відрізняється, встановіть температуру відпалу на 5 ℃ нижче, ніж найнижча Tm.В якості альтернативи, щоб підвищити специфічність, спочатку можна виконати п’ять циклів при температурах відпалу, розрахованих на вищу Tm, а потім інші цикли при температурах відпалу, розрахованих на нижчу Tm.Це дозволяє отримати часткову копію цільового шаблону в жорстких умовах.
4. Чистота і стабільність грунтовки
Стандартна чистота спеціальних праймерів є достатньою для більшості застосувань ПЛР.Видалення бензоїльних та ізобутилільних груп шляхом знесолення є мінімальним і тому не заважає ПЛР.Деякі програми потребують очищення, щоб видалити будь-які неповні послідовності в процесі синтезу.Ці усічені послідовності виникають тому, що ефективність хімічного синтезу ДНК не є 100%.Це циклічний процес, у якому використовуються повторювані хімічні реакції, оскільки кожна основа додається для створення ДНК від 3′ до 5′.Ви можете зазнати невдачі в будь-якому циклі.Довші праймери, особливо ті, що мають понад 50 основ, мають велику частку усічених послідовностей і можуть вимагати очищення.
На вихід праймерів впливає ефективність синтетичної хімії та методу очищення.Біофармацевтичні компанії, такі як Cytology і Shengong, усі використовують мінімальну одиницю оптичної щільності, щоб забезпечити загальний вихід олігонуклеозиду.Праймери на замовлення поставляються у вигляді сухого порошку.Найкраще повторно розчинити праймери в ТЕ, щоб кінцева концентрація становила 100 мкМ.TE краще, ніж деіонізована вода, оскільки рН води часто кислий і спричиняє гідроліз олігонуклеозидів.
Стійкість грунтовок залежить від умов зберігання.Сухий порошок і розчинені праймери слід зберігати при -20 ℃.Праймери, розчинені в TE в концентраціях понад 10 мкМ, можна стабільно зберігати при -20 ℃ протягом 6 місяців, але можна зберігати лише при кімнатній температурі (від 15 ℃ до 30 ℃) менше 1 тижня.Сухі порошкові праймери можна зберігати при -20 C протягом принаймні 1 року та при кімнатній температурі (15 C до 30 C) до 2 місяців.
5. Ферменти та їх концентрації
В даний час використовувана ДНК-полімераза Taq в основному є генно-інженерним ферментом, синтезованим коліформними бактеріями.Кількість ферменту, необхідного для каталізації типової ПЛР-реакції, становить приблизно 2,5 U (відноситься до загального об’єму реакції 100 мкл).Якщо концентрація занадто висока, це може призвести до неспецифічної ампліфікації;якщо концентрація занадто низька, кількість синтетичного продукту буде зменшено.
6. Якість і концентрація dNTP
Якість dNTP тісно пов'язана з концентрацією та ефективністю ПЛР-ампліфікації.Порошок dNTP гранульований, і його мінливість втрачає свою біологічну активність при неправильному зберіганні.Розчин dNTP є кислим і його слід використовувати у високій концентрації з 1М NaOH або 1М буферним розчином Tris.HCL, щоб відрегулювати його PH до 7,0 ~ 7,5, невелика кількість вторинної упаковки, зберігання в замороженому стані при -20 ℃.Багаторазове заморожування-відтавання призведе до погіршення dNTP.У реакції ПЛР dNTP має бути 50 ~ 200 мкмоль/л.Особливо слід звернути увагу на те, щоб концентрація чотирьох ДНТПС була рівною (однаковий мольний препарат).Якщо концентрація будь-якого з них відрізняється від інших (вища чи нижча), виникне невідповідність.Занадто низька концентрація зменшить вихід продуктів ПЛР.dNTP може з'єднуватися з Mg2+ і знижувати концентрацію вільного Mg2+.
7. Матрична (ген-мішень) нуклеїнова кислота
Кількість і ступінь очищення матричної нуклеїнової кислоти є однією з ключових ланок успіху чи невдачі ПЛР.Традиційні методи очищення ДНК зазвичай використовують SDS і протеазу K для перетравлення та утилізації зразків.Основними функціями SDS є: розчиняти ліпіди та білки на клітинній мембрані, таким чином руйнуючи клітинну мембрану шляхом розчинення мембранних білків, і дисоціювати ядерні білки в клітині, SDS також може поєднуватися з білками та випадати в осад;Протеаза K може гідролізувати та перетравлювати білки, особливо гістони, пов’язані з ДНК, а потім використовувати органічний розчинник фенол і хлороформ для вилучення білків та інших компонентів клітини та використовувати етанол або ізопропіловий спирт для осадження нуклеїнової кислоти.Екстрагована нуклеїнова кислота може бути використана як матриця для реакцій ПЛР.Для загального клінічного виявлення зразків можна використовувати швидкий і простий метод для розчинення клітин, лізування патогенів, перетравлення та видалення білків із хромосом до вільних генів-мішеней, а також для безпосереднього використання для ампліфікації ПЛР.Для екстракції матриці РНК зазвичай використовується метод ізотіоціанату гуанідину або протеази К, щоб запобігти деградації РНКази РНК.
8. Концентрація Mg2+
Mg2+ істотно впливає на специфічність і вихід ПЛР-ампліфікації.У загальній реакції ПЛР, коли концентрація різних dNTP становить 200 мкмоль/л, відповідна концентрація Mg2+ становить 1,5 ~ 2,0 ммоль/л.Концентрація Mg2+ надто висока, специфічність реакції знижується, відбувається неспецифічна ампліфікація, занадто низька концентрація призведе до зниження активності ДНК-полімерази Taq, що призведе до зменшення продуктів реакції.
Іони магнію впливають на кілька аспектів ПЛР, таких як активність ДНК-полімерази, яка впливає на врожайність;Іншим прикладом є відпал праймера, який впливає на специфічність.dNTP і матриця зв'язуються з іоном магнію, зменшуючи кількість вільного іона магнію, необхідного для активності ферменту.Оптимальна концентрація іонів магнію різна для різних пар праймерів і матриць, але типова початкова концентрація ПЛР з 200 мкМ dNTP становить 1,5 мМ (примітка: для кількісної ПЛР у реальному часі використовуйте розчин іонів магнію від 3 до 5 мМ з флуоресцентним зондом).Більш високі концентрації вільних іонів магнію збільшують вихід, але також збільшують неспецифічну ампліфікацію та знижують точність.Щоб визначити оптимальну концентрацію, проводили титрування іонів магнію з кроком 0,5 мМ від 1 мМ до 3 мМ.Для зменшення залежності від оптимізації іонів магнію можна використовувати ДНК-полімеразу Platinum Taq.ДНК-полімераза Platinum Taq здатна підтримувати функцію в ширшому діапазоні концентрацій іонів магнію, ніж ДНК-полімераза Taq, і тому потребує менше оптимізації.
9. Pcr-стимулюючі добавки
Оптимізації температури відпалу, конструкції праймера та концентрації іонів магнію достатньо для високоспецифічної ампліфікації більшості матриць;однак для деяких шаблонів, у тому числі з високим вмістом GC, потрібні додаткові заходи.Добавки, які впливають на температуру плавлення ДНК, забезпечують ще один спосіб покращення специфічності продукту та виходу.Для найкращих результатів потрібна повна денатурація шаблону.
Крім того, вторинна структура перешкоджає зв'язуванню праймера та подовженню ферменту.
Добавки до ПЛР, включаючи формамід, ДМСО, гліцерин, бетаїн і розчин підсилювача ПЛР, посилюють ампліфікацію.Їх можливий механізм полягає в зниженні температури плавлення, таким чином сприяючи відпалу праймерів і сприяючи подовженню ДНК-полімерази через область вторинної структури.PCRx Solution має й інші переваги.При використанні з ДНК-полімеразою Platinum Taq і ДНК-полімеразою Platinum Pfx потрібна мінімальна оптимізація іонів магнію.Таким чином, метод Platinum поєднується з добавкою для підвищення специфічності, одночасно зменшуючи залежність від третього підходу, оптимізації іонів магнію.Для досягнення найкращих результатів слід оптимізувати концентрацію добавок, особливо ДМСО, формаміду та гліцерину, які інгібують Taq ДНК-полімеразу.
10. Гарячий старт
ПЛР з гарячим стартом є одним із найважливіших методів покращення специфічності ПЛР на додаток до якісного дизайну праймера.Хоча оптимальна температура подовження Taq ДНК-полімерази становить 72 ℃, полімераза залишається активною при кімнатній температурі.Таким чином, неспецифічні продукти утворюються, коли температура витримки нижча за температуру відпалу під час підготовки реакції ПЛР і на початку термічного циклу.Утворившись, ці неспецифічні продукти ефективно посилюються.ПЛР з гарячим стартом особливо ефективна, коли сайти, які використовуються для розробки праймерів, обмежені розташуванням генетичних елементів, таких як сайт-спрямовані мутації, клонування експресії або конструювання та маніпуляції з генетичними елементами, які використовуються для інженерії ДНК.
Поширеним методом обмеження активності ДНК-полімерази Taq є приготування реакційного розчину для ПЛР на льоду та розміщення його в попередньо нагрітому апараті для ПЛР.Цей метод простий і недорогий, але він не завершує активність ферменту і, отже, не усуває повністю ампліфікацію неспецифічних продуктів.
Термічний праймінг затримує синтез ДНК шляхом інгібування важливого компонента, доки апарат ПЛР не досягне температури денатурації.Більшість ручних методів термічної ініціації, включаючи відстрочене додавання ДНК-полімерази Taq, є громіздкими, особливо для застосування з високою пропускною здатністю.В інших методах термічної ґрунтовки використовується восковий екран, щоб укрити важливий компонент, включаючи іони магнію або ферменти, або фізично ізолювати реактивні компоненти, такі як шаблони та буфери.Під час термічного циклу різні компоненти виділяються та змішуються разом, коли віск плавиться.Подібно до методу ручного гарячого запуску, метод воскового захисту є громіздким і схильним до забруднення, а також не підходить для застосування з високою пропускною здатністю.
Платинова ДНК-полімераза зручна та ефективна для автоматичної гарячої ПЛР.ДНК-полімераза Platinum Taq складається з рекомбінантної ДНК-полімерази Taq у поєднанні з моноклональним антитілом проти ДНК-полімерази Taq.Антитіла створені методом ПЛР для пригнічення активності ферментів під час тривалого витримування температури.ДНК-полімераза Taq була випущена в реакцію під час ізоляції при 94 ℃ на етапі денатурації, відновлюючи повну активність полімерази.На відміну від хімічно модифікованої Taq ДНК-полімерази для термічної ініціації, платиновий ензим не потребує тривалої ізоляції при 94 ℃ (від 10 до 15 хвилин) для активації полімерази.За допомогою ДНК-полімерази PlatinumTaq 90% активності ДНК-полімерази Taq було відновлено через 2 хвилини при 94 ℃.
11. Гніздо-ПЛР
Послідовні раунди ампліфікації з використанням вкладених праймерів можуть покращити специфічність і чутливість.Перший раунд - це стандартна ампліфікація від 15 до 20 циклів.Невелику фракцію початкового продукту ампліфікації розбавляли в 100-1000 разів і додавали до другого циклу ампліфікації протягом 15-20 циклів.Альтернативно, розмір початкового ампліфікованого продукту можна визначити за допомогою очищення гелю.У другому циклі ампліфікації використовується вкладений праймер, який може зв’язуватися з цільовою послідовністю всередині першого праймера.Використання вкладеної ПЛР зменшує можливість ампліфікації кількох сайтів-мішеней, оскільки є кілька цільових послідовностей, комплементарних до обох наборів праймерів.Така ж загальна кількість циклів (від 30 до 40) з однаковими праймерами ампліфікувала неспецифічні сайти.Вкладена ПЛР підвищує чутливість обмежених цільових послідовностей (наприклад, рідкісних мРНК) і покращує специфічність складного PCRS (наприклад, 5′ RACE).
12. Низхідна ПЛР
Низхідна ПЛР покращує специфічність завдяки використанню жорстких умов відпалу протягом перших кількох циклів ПЛР.Цикл починається при температурі відпалу, яка приблизно на 5 ℃ вища за розрахункову Tm, потім кожен цикл зменшується на 1–2 ℃, доки температура відпалу не стане нижче Tm 5 ℃.Буде розширено лише шаблон призначення з найвищою гомологією.Ці продукти продовжують розширюватися в наступних циклах, витісняючи посилені неспецифічні продукти.Низхідна ПЛР корисна для методів, де ступінь гомології між праймером і цільовою матрицею невідомий, наприклад, для відбитків пальців ДНК AFLP.
Пов’язані набори для ПЛР
Герой 2× ПЛРTMСистема Mix має вищу толерантність до інгібіторів ПЛР, ніж звичайна система PCR Mix, і може легко впоратися з ПЛР-ампліфікацією різних складних матриць.Унікальна реакційна система та високоефективний Taq Hero роблять ПЛР-реакцію вищою ефективністю ампліфікації, специфічністю та чутливістю.
Вища ефективність підсилення
Він має 5'→3' ДНК-полімеразну активність і 5'→3' екзонуклеазну активність, без 3'→5' екзонуклеазної активності.
ПЛР у реальному часі Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Специфічний — оптимізований буфер і гарячий стартовий фермент Taq можуть запобігти неспецифічній ампліфікації та утворенню димера праймера
Висока чутливість — може виявити низькі копії шаблону
У наборі використовується унікальний реагент зворотної транскрипції Foregene та ДНК-полімераза Foregene HotStar Taq у поєднанні з унікальною реакційною системою для ефективного підвищення ефективності ампліфікації та специфічності реакції.
Час публікації: травень-09-2023
