Специфіка виявлення
У більшості випадків метою розробки праймерів є максимізація специфічності ПЛР.Це визначається більш-менш передбачуваним впливом багатьох змінних.Однією важливою змінною є послідовність на 3′-кінці праймера.
Важливо, що аналізи ПЛР, розроблені для визначення специфічності, мають більшу ймовірність підтримувати високу ефективність у широкому динамічному діапазоні, оскільки аналіз не виробляє неспецифічних продуктів ампліфікації, таким чином конкуруючи з реагентами ПЛР або пригнічуючи основну реакцію ампліфікації.
Звичайно, у деяких випадках специфічність не є найважливішою, наприклад, коли метою є кількісне визначення тісно пов’язаних, але різних патогенів, потрібні спеціальні стандарти розробки, оптимізації та перевірки.
Крива плавлення є стандартним методом для оцінки специфічності ампліконів, принаймні з точки зору того, чи потрібно ампліфікувати одну мішень.Однак слід підкреслити, що криві плавлення можуть вводити в оману, оскільки, наприклад, на них може вплинути комбінований вплив субоптимальних праймерів і низьких концентрацій матриці.
P5 |Крива плавлення показує зрушення Tm, отримані в результаті двох виявлень різних кількостей двох цільових ДНК.
A. При більш високих концентраціях (ad)) після завершення вимірювання кПЦР немає очевидного димеру праймера.Коли концентрація шаблону зменшується до 50 копій (e), починає з’являтися неспецифічний продукт і стає єдиним продуктом із найнижчою концентрацією (f).
B. Тест зафіксував однакову Tms при всіх цільових концентраціях, і не було очевидного димеру праймера навіть при найнижчій концентрації (5 копій).При використанні цих двох методів виявлення продуктів ампліфікації в НТК виявлено не було.
P5 показує криві розчинення, отримані із зразками, в яких шаблон присутній у різних концентраціях.P 5a показує, що при двох найнижчих концентраціях Tms утворених неспецифічних продуктів ампліфікації нижчий, ніж у специфічних ампліконів.
Очевидно, що цей метод виявлення не можна надійно використовувати для виявлення цілей, які існують у низьких концентраціях.
Цікаво, що NTC, тобто зразки без ДНК взагалі, не реєстрували (неспецифічні) продукти ампліфікації, що вказує на те, що фонова геномна ДНК може брати участь у неспецифічній ампліфікації/полімеризації.
Іноді такі фонові праймери та неспецифічну ампліфікацію неможливо виправити, але часто можна розробити метод виявлення, який не має неспецифічної ампліфікації в будь-якій концентрації матриці та NTC (P 5b).
Тут навіть запис посилення цільової концентрації з Cq 35 дасть специфічну криву розчинення.Подібним чином, NTCs не виявляли ознак неспецифічної ампліфікації.Іноді поведінка виявлення може залежати від маточного розчину, і в певних буферних композиціях виявляється лише неспецифічна ампліфікація, яка може бути пов’язана з різними концентраціями Mg2+.
Стабільність виявлення
Оптимізація Ta є корисним кроком у процесі емпіричної перевірки та оптимізації детекції кПЛР.Він забезпечує пряму індикацію стійкості набору праймерів, показуючи температуру (або температурний діапазон), яка дає найнижчий Cq без посилення NTC.
Різниця в чутливості в два-чотири рази може бути не важливою для людей з високою експресією мРНК, але для діагностичних тестів це може означати різницю між позитивними та хибнонегативними результатами.
Властивості Ta праймерів qPCR можуть сильно відрізнятися.Деякі тести не дуже надійні, і якщо вони не виконуються за оптимального значення Ta праймерів, вони швидко зруйнуються.
Це важливо, оскільки цей тип виявлення часто є проблематичним у реальному світі, а чистота зразка, концентрація ДНК або наявність іншої ДНК можуть бути неоптимальними.
Крім того, цільова кількість копій може змінюватися в широкому діапазоні, а реагенти, пластиковий посуд або інструменти можуть відрізнятися від тих, що використовувалися під час налаштування тесту.
P6|Градієнт температури показує різну надійність виявлення ПЛР.
A. Використовуйте Mastermix Sensifast SYBR від Bioline (каталожний номер BIO-98050) для проведення ПЛР на кДНК, отриманій з РНК мозку людини.
B. Використовуйте прилад Bio-Rad CFX qPCR, щоб записати карту ампліфікації та криву розчинення апалену (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Графік ампліфікації та крива плавлення ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Графік ампліфікації та крива розчинення GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs, записані при різних температурах відпалу, показуючи різницю в Cq, записаних під градієнтом температури 7C.
P 6 показує типовий результат небажаного тесту, де КПЦР проводили з використанням градієнта Tas між 59C і 67C (P 6a), використовуючи праймери для трьох генів, специфічних для мозку людини.
З графіка ампліфікації можна побачити, що праймери Opalin далекі від ідеальних, оскільки їх оптимальний діапазон Ta дуже вузький (Малюнок 6b), тобто Cqs широко розсіяні, в результаті чого Cqs значно порівняно з їх оптимальним Cqs Low.
Цей метод виявлення нестабільний і може призвести до неоптимального посилення.Тому цю пару праймерів слід переробити.Крім того, аналіз кривої плавлення (вставка) показує, що специфічність цього методу виявлення також може бути проблематичною, оскільки крива плавлення кожного Ta є різною.
Метод виявлення ACSBG1, показаний у P 6c, є більш надійним, ніж метод виявлення Opalin вище, але він все ще далекий від ідеального, і, ймовірно, його можна вдосконалити.
Однак ми підкреслюємо, що немає необхідного зв’язку між надійністю та специфічністю, оскільки крива розчинення, отримана цим методом виявлення, показує однакове пікове значення для всіх Tas (вставка).
З іншого боку, тест на міцність є набагато толерантнішим, виробляючи подібні Cq у широкому діапазоні Tas, як у тесті GFAP, показаному на P 6d.
Різниця в Cqs, отриманих у тому ж діапазоні 8 градусів Цельсія, менше 1, а крива розчинення (вставка) підтверджує характеристики виявлення в цьому діапазоні температур.Варто зазначити, що розрахований Tas і фактичний діапазон Ta можуть сильно відрізнятися.
Існує багато вказівок, розроблених, щоб допомогти дослідникам розробити ефективні праймери, більшість з яких базуються на давно встановлених правилах, і багато уваги приділено 3′-кінцю праймерів.Часто рекомендується включати G або C на кінці 3' і дві основи G або C (затискач GC), але не більше двох з останніх 5 основ.
На практиці ці правила можуть керувати дослідниками, але вони не обов’язково є правильними за всіх обставин.
P7 |3′-кінець праймера мало впливає на специфічність або ефективність.
A. Положення праймерів для гена HIF-1α людини (NM_181054.2).
B. Використовуйте матковий розчин Agilent Brilliant III SYBR Green (Кат. № 600882), щоб ампліфікувати шість досліджуваних елементів.
C. Графік ампліфікації та крива плавлення, записані приладом CFX qPCR від Bio-Rad та 3′-кінцевими праймерами.NTC відображаються червоним кольором.
D. Запис Cqs кожного тестового завдання
Наприклад, результат у P 7 суперечить правилу 3′-кінця.Усі конструкції дають в основному однакові результати, лише дві комбінації праймерів призводять до неспецифічної ампліфікації NTC.
Однак ми не можемо підтримати ефект кліпу GC, тому що в цьому випадку використання A або T як максимум 30 основ не зменшує специфічність.
Тест C, де F-праймер закінчується на GGCC, записав Cq в NTC, що вказує на те, що можна уникнути цих послідовностей на 30-кінці.Ми підкреслюємо, що єдиний спосіб визначити найкращу 3′-кінцеву послідовність пари праймерів - це експериментально оцінити деякі кандидати на праймери.
Ефективність посилення
Важливо відзначити, що хоча неспецифічне виявлення ПЛР ніколи не може стати специфічним, ефективність ампліфікації можна регулювати та максимізувати різними способами шляхом зміни ферменту, маточного розчину, добавок та умов циклу.
Для оцінки ефективності детекції ПЛР найкраще використовувати серійне розведення цільової нуклеїнової кислоти в 10 або 5 разів, тобто «метод стандартної кривої».
Якщо для створення стандартної кривої використовуються ПЛР-амплікони або синтетичні ДНК-мішені, серійні розведення цих мішеней слід змішувати з постійною кількістю фонової ДНК (наприклад, геномної ДНК).
P8 |Крива розведення для оцінки ефективності ПЛР.
A. Використовуйте праймери для HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA і R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC і головну суміш Agilent Brilliant III SYBR Green (каталожний номер 600882) для ПЛР і умов кривої плавлення.
B. 100 нг РНК було зворотно транскрибовано, розведено в 2 рази, а серійно розведені зразки кДНК були розведені в 5 разів до 1 нг геномної ДНК людини.На вставці показана крива плавлення.
C. Реакцію RT, розведення та серійне розведення повторювали для другого зразка кДНК, і результати були подібними.
P 8 показує дві стандартні криві з використанням того самого методу виявлення на двох різних зразках кДНК, результат є однаковою ефективністю, приблизно 100%, і значення R2 також подібне, тобто ступінь відповідності між експериментальними даними та лінією регресії або ступенем лінійності даних.
Дві стандартні криві можна порівняти, але не зовсім однакові.Якщо метою є точне кількісне визначення цілі, слід зазначити, що неприйнятно надавати розрахунок кількості копій без пояснення невизначеності
P9 |Невизначеність вимірювання, пов’язана з кількісним визначенням за допомогою стандартної кривої.
A. Використовуйте праймери для GAPDH (NM_002046) для проведення ПЛР та умов кривої плавлення.F: ACAGTTGCCATGTAGACC і R: TAACTGGTTGAGCACAGG і Mastermix Sensifast SYBR від Bioline (каталожний номер BIO-98050).
B. Діаграма ампліфікації, крива плавлення та стандартна крива, записані за допомогою приладу CFX qPCR від Bio-Rad.
C. Графік стандартної кривої та 95% довірчий інтервал (ДІ).
D. Кількість копій і 95% довірчий інтервал трьох значень Cq, отриманих з кривої розведення.
P 9 показує, що для оптимізованого тесту притаманна мінливість однієї стандартної кривої становить приблизно 2 рази (95% довірчий інтервал, від мінімуму до максимуму), що може бути найменшою мінливістю, яку можна очікувати.
Пов'язаний продукт:
Набір Animal Tissue Direct PCR
Час публікації: 30 вересня 2021 р
