RT-qPCR є основним експериментом молекулярної біології, і кожен повинен бути з ним знайомий.В основному він включає три етапи: екстракцію РНК, зворотну транскрипцію в кДНК і флуоресцентну кількісну ПЛР у реальному часі.Це не допомагає, що відбувається?Ймовірно, що є проблема зексперимент із зворотною транскрипцією!Хоча здається, що для експерименту зі зворотною транскрипцією потрібно лише додати РНК, dNTP, праймери тазворотна транскриптазау центрифужну пробірку та добре перемішайте, але в процесі фактичної роботи ще є багато деталей, на які потрібно звернути увагу.Давайте дізнаємося про це!

Як судити про якість РНК?
Для отримання кДНК якість РНК має вирішальне значення!Якість РНК можна визначити в основному з двох аспектів:
(1) Цілісність РНК:Цілісність РНК можна перевірити за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Взявши, наприклад, еукаріоти, повна сумарна РНК має три чіткі смуги, молекулярні маси від великої до малої становлять 28S, 18S і 5S, а 28S вдвічі яскравіша за 18S;якщо можна побачити три смуги, але тип смуги розмитий або дифузія означає, що РНК частково деградувала.У цей час негайно виконайте реакцію зворотної транскрипції та відповідно збільште введений шаблон;якщо можна побачити лише смугу з невеликою молекулярною масою або смугу не побачити, РНК повністю деградувала та потребує повторного екстрагування.Agilent 2100 показує цілісність РНК за допомогою пікової діаграми та значення RIN.Якщо нуклеїнова кислота інтактна, базова лінія електроферограми плоска;якщо нуклеїнова кислота сильно розкладається, базова лінія є нерівномірною і з’являється більше піків розпаду;значення RIN відображає цілісність РНК в межах 0-10, чим більше значення, тим краща якість РНК.Ну, тим вище ступінь повноти.
(2) Чистота РНК:Співвідношення OD260/280 можна визначити за допомогою УФ-спектрофотометрії.Якщо співвідношення OD260/280 становить від 1,9 до 2,1, чистота дуже добра.
Залишки геномної ДНК можуть призвести до неточних кількісних результатів
Коли РНК екстрагується, РНК, яку ми отримуємо, може бути змішана з геномною ДНК (гДНК), яка не була очищена.Таким чином, кДНК після зворотної транскрипції також буде змішана згДНК.Під час течіїКПЦРреакція,кДНКі gDNA можуть бути ампліфіковані одночасно, що призводить до відносно малого значення CT, тому результати можуть бути зміщеними.
Отже, що нам робити в цій ситуації?Foregeneпропонує:
(1) Виконати очищення генома реверсованої РНК, яку можна видалити екстракцією колонки під час екстракції РНК;
(2) Обробіть екстраговану РНК ДНКазоюI , але закінчити його EDTA;
реагентів зворотної транскрипціїз модулями очищення геному;

Як вибрати праймери для зворотної транскрипції?
Праймери зворотної транскрипції також впливають на результат реакції зворотної транскрипції.Ви можете вибрати випадкові праймери, Oligo dT або ген-специфічні праймери для зворотної транскрипції відповідно до конкретних обставин експерименту:
(1) Конкретні стенограми: рекомендуються генно-специфічні праймери;
(2) Довгі стенограми фрагментів: рекомендовані Oligo dT/геноспецифічні праймери;
(3) Внутрішні фрагменти довгосегментних транскриптів: ген-специфічні праймери/випадкові праймери/випадкові праймери + Oligo dT.Якщо буде проведено наступний експеримент qPCR, Oligo dT не можна використовувати окремо, оскільки використання лише Oligo dT може спричинити зсув 3'-кінця, що призведе до неточних результатів експерименту qPCR;
(4) мікроРНК: Можна використовувати грунтовки для стовбурової петлі або хвостові грунтовки.

У скільки разів слід розводити кДНК продукту зворотної транскрипції для кількісного визначення?
Після отримання кДНК продукту зворотної транскрипції дуже важливо, у скільки разів кДНК слід розбавити для експериментів кПЦР.Якщо концентрація кДНК занадто висока або занадто низька, це може вплинути на ефективність ампліфікації.Чи можна виміряти концентрацію кДНК і як це зробити?
(1) Концентрація кДНК продукту зворотної транскрипції не може бути виміряна, оскільки крім продукту кДНК, продукт зворотної транскрипції також містить залишковий буфер зворотної транскрипції, зворотну транскриптазу, праймери тощо, які впливатимуть на результати вимірювання концентрації та спричинятимуть аномальне співвідношення OD260/280, OD260/230 і, отже, не відображатимуть справжній вихід кДНК.У цей час деякі друзі скажуть, що я буду вимірювати концентрацію після очищення;Тут Foregene хотів би нагадати, що кДНК не рекомендується очищати, оскільки довжина кДНК, отримана реверсією, відрізняється, і коротка кДНК буде втрачена під час очищення.
(2) То що робити?Перед експериментом qPCR градієнт розведення кДНК можна визначити за допомогою попереднього експерименту.Наприклад: використовуйте базовий розчин кДНК, 10-кратне розведення та 100-кратне розведення як шаблони для експериментів із кПЦР та виберіть коефіцієнт розведення зі значенням CT у діапазоні 18-28.

Як слід здійснювати зворотну транскрипцію мікроРНК?
мікроРНК — це одноланцюгова невелика молекула РНК розміром приблизно 22 нт, яка не кодує білок.Через його коротку довжину звичайний метод qPCR важко безпосередньо кількісно визначити, тому часто необхідно розширювати мікроРНК;широко використовувані методи зворотної транскрипції мікроРНК включають метод стовбурової петлі та метод хвоста.
Метод стовбурової петлі полягає в розширенні мікроРНК шляхом додавання праймерів стовбурової петлі.Цей метод виявлення має вищу чутливість і специфічність, але пропускна здатність виявлення низька.Одна зворотна транскрипція може виявити лише одну мікроРНК і внутрішню референцію;метод додавання хвоста складається з двох. Він завершується спільною дією двох ферментів, якими є полімераза PolyA та зворотна транскриптаза.Полімераза PolyA відповідає за додавання хвостів PolyA до мікроРНК для збільшення її довжини, а зворотна транскриптаза виконує реакцію зворотної транскрипції.Цей метод має високу пропускну здатність виявлення та може виявляти кілька мікроРНК і внутрішні посилання в одній зворотній транскрипції, але чутливість і специфічність у методі стовбурової петлі низькі.