Флуоресцентна кількісна ПЛР (також відома як TaqMan PCR, далі FQ-PCR) — це нова технологія кількісного визначення нуклеїнових кислот, розроблена PE (Perkin Elmer) у Сполучених Штатах у 1995 році. Ця технологія базується на звичайній ПЛР шляхом додавання флуоресцентно мічених зондів.У порівнянні з гнучкою ПЛР FQ-ПЛР має багато переваг для реалізації своєї кількісної функції.Ця стаття має на меті коротко описати характеристики, принципи, методи та застосування технології.
1 Особливості
FQ-PCR не тільки має високу чутливість звичайної ПЛР, але також завдяки застосуванню флуоресцентних зондів він може безпосередньо виявляти зміну флуоресцентного сигналу під час ампліфікації ПЛР через систему фотоелектричної провідності для отримання кількісних результатів, що усуває багато недоліків звичайної ПЛР, тому він також має високу специфічність гібридизації ДНК і високу точність технології спектроскопії.
Наприклад, загальні продукти ПЛР необхідно перевіряти за допомогою електрофорезу в агарозному гелі та фарбування бромістим етидієм ультрафіолетовим світлом або електрофорезу в поліакриламідному гелі та фарбування сріблом.Це вимагає не тільки кількох інструментів, але й часу та зусиль.Використані плями броміду етідію шкідливі для людського організму, і ці складні експериментальні процедури створюють можливості для забруднення та помилкових спрацьовувань.Однак для FQ-PCR потрібно лише один раз відкрити кришку під час завантаження зразка, а подальший процес є повністю закритою пробіркою, яка не потребує подальшої обробки ПЛР, що дозволяє уникнути багатьох недоліків у звичайних операціях ПЛР.В експерименті зазвичай використовується термоциклер ABI7100 PCR, розроблений компанією PE.
Прилад має такі характеристики: ① Широке застосування: його можна використовувати для кількісного визначення продуктів ПЛР ДНК і РНК, дослідження експресії генів, виявлення патогенів та оптимізації умов ПЛР.② Унікальний кількісний принцип: використання флуоресцентно мічених зондів кількість флуоресценції буде накопичуватися в циклі ПЛР після лазерного збудження, щоб досягти мети кількісного визначення.③ Висока ефективність роботи: вбудований термоциклер 9600 ПЛР, керований комп’ютером від 1 до 2 годин, щоб завершити ампліфікацію та кількісне визначення 96 зразків автоматично та синхронно.④ Немає необхідності в гелевому електрофорезі: немає необхідності розводити та проводити електрофорез зразка, просто використовуйте спеціальний зонд для визначення безпосередньо в реакційній пробірці.⑤Відсутність забруднення в трубопроводі: застосовано унікальну повністю закриту реакційну трубку та систему фотоелектричної провідності, тому немає необхідності турбуватися про забруднення.⑥Результати відтворювані: кількісний динамічний діапазон становить до п’яти порядків величини.Тому, оскільки ця технологія була успішно розроблена, вона була оцінена багатьма науковими дослідниками та застосована в багатьох галузях.
2 Принципи та методи
Принцип роботи FQ-ПЛР полягає у використанні 5′→3′ екзонуклеазної активності ферменту Taq для додавання флуоресцентно міченого зонда до реакційної системи ПЛР.Зонд може специфічно гібридизуватися з шаблоном ДНК, що міститься в послідовності праймера.5'-кінець зонда позначено геном випромінювання флуоресценції FAM (6-карбоксифлуоресцеїн, пік випромінювання флуоресценції при 518 нм), а 3'-кінець позначено групою гасіння флуоресценції TAMRA (6-карбокситетраметилродамін, пік випромінювання флуоресценції при 582 нм), 3'-початок зонда фосфорилюється, щоб запобігти подовженню зонда під час ПЛР-ампліфікації.Коли зонд залишається недоторканим, група гасника пригнічує випромінювання флуоресценції випромінюючої групи.Після того, як випромінюючу групу відокремлюють від групи гасіння, інгібування скасовується, і оптична щільність при 518 нм збільшується та виявляється системою виявлення флуоресценції. У фазі ренатурації зонд гібридизується з ДНК-матрицею, а фермент Taq у фазі подовження рухається вздовж матриці ДНК разом із подовженням праймера.Коли зонд відсікається, ефект гасіння вивільняється і флуоресцентний сигнал вивільняється.Кожного разу, коли шаблон копіюється, зонд відсікається, що супроводжується вивільненням флуоресцентного сигналу.Оскільки існує однозначний зв’язок між кількістю вивільнених флуорофорів і кількістю продуктів ПЛР, цей метод можна використовувати для точного кількісного визначення матриці.Експериментальний прилад зазвичай використовує термоциклер ABI7100 PCR, розроблений компанією PE, і також можна використовувати інші термоциклери.Якщо для експерименту використовується реакційна система типу ABI7700, після завершення реакції кількісні результати можна отримати безпосередньо за допомогою комп’ютерного аналізу.Якщо ви використовуєте інші термоциклери, вам потрібно використовувати детектор флуоресценції для вимірювання сигналу флуоресценції в реакційній пробірці одночасно для обчислення RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ являє собою відношення інтенсивності люмінесценції групи флуоресцентного випромінювання пробірки із зразком до інтенсивності люмінесценції групи гасіння, RQ- являє собою співвідношення двох у порожній пробірці, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) являє собою величину зміни сигналу флуоресценції під час ПЛР. Після обробки даних можна отримати кількісні результати.Завдяки введенню флуоресцентних зондів специфічність експерименту значно покращується.Конструкція зонда загалом має відповідати таким умовам: ①Довжина зонда має становити приблизно 20-40 основ, щоб забезпечити специфічність зв’язування.②Вміст основ GC становить від 40% до 60%, щоб уникнути дублювання окремих нуклеотидних послідовностей.③ Уникайте гібридизації або накладання праймерів.④ Стабільність зв’язування між зондом і матрицею більша, ніж стабільність зв’язування між праймером і матрицею, тому значення Tm зонда має бути щонайменше на 5°C вищим за значення Tm праймера.Крім того, концентрація зонда, гомологія між зондом і послідовністю матриці та відстань між зондом і праймером впливають на результати експерименту.
Супутні товари:
Китай ПЛР у реальному часі Easyᵀᴹ-Taqman Виробник і постачальник |Foregene (foreivd.com)
Час публікації: 15 жовтня 2021 р
