РНКаза — це делікатне слово, яке не хочуть чути багато студентів, які часто проводять експерименти з виділення РНК.У повному озброєнні РНК, яка була нарешті екстрагована високотоксичними реагентами фенолом і хлороформом, була розкладена.Я не мирюся!!!Сьогодні давайте подивимося на походження знаменитої Rnase.

Рибонуклеаза (РНКаза) або РНКаза — це нуклеаза, здатна гідролізувати РНК на малі молекули.РНКаза, як маломолекулярний білок, надзвичайно стабільна .Звичайна парова стерилізація при високій температурі та високому тиску та інгібітори протеїну не можуть повністю деактивувати його.Стабільність РНКази головним чином походить від дисульфідних зв’язків у структурі.Наприклад, широко використовувана РНКаза підшлункової залози великої рогатої худоби містить лише 124 амінокислоти, але містить 4 дисульфідні зв’язки.Сірчаний зв’язок і дисульфідний зв’язок надають РНКазі чудову термічну стабільність.Крім того, Рназа має відносно малу молекулярну масу і може швидко відновлювати свою початкову конформацію в багатьох випадках.

Окрім надзвичайної стабільності,РНКази всюдисущі в лабораторії .РНКаза є механізмом біологічного захисту.Для клітини екзогенна РНК часто є фатальною.У порівнянні з екзогенною ДНК, екзогенна РНК часто більш небезпечна.РНК успішно транскрибується та транслюється, тому майже всі організми розвинули РНКази для захисту від вторгнення екзогенної РНК.Тому бактеріальні клітини, культивовані в лабораторії, і ви, хто виділяєте РНК, виділяють аромат РНКази.Рідини людського організму (слина, сльози тощо) містять велику кількість РНКази, тому не плачте, коли РНК руйнується.Чим більше ви плачете, тим гірше розпад РНК!!Сестра Дайю не підходить для виділення РНК!

Крім того, ваша ніжна шкіра також містить багато РНКази, а маркери, піпетки, дверцята холодильника та дверні ручки, до яких торкалася шкіра, також містять РНКазу.

Через стільки балаканини, давайте подивимося, як боротися з РНКазами.

Перше, про що всі думають при видаленні РНК, цеDEPC(діетилпірокарбонат).DEPC головним чином денатурує білок шляхом поєднання з імідазоловим кільцем активної групи РНКази гістидину, тим самим пригнічуючи активність ферменту.0,1% DEPC може мати кращий ефект видалення Рнази, але ми повинні звернути увагу, що DEPC є відомим канцерогеном, тому при його використанні слід приділяти особливу увагу.

Для РНКази ми повинні почати з двох аспектів,перший полягає в інгібуванні активності ендогенної РНКази

Звичайні реагенти для екстракції РНК, такі як гуанідинізотіоціанат і DTT, що містяться в Тризолі, можуть розкрити дисульфідний зв’язок РНКази, але все ще є деякі РНКази, особливо в зразках тканин, тому зверніть увагу на низьку температуру.

1.Одразу занурте зразок тканини в рідкий азот після того, як його витягли, або в комерційний розчин для збереження РНК.

2.Після екстрагування РНК із зразка клітини додайте її до розчину для лізису та лізуйте на коробці з льодом

3. Для подрібнення найкраще використовувати рідкий азот коли зразки тканини гомогенізовані.При використанні електричного гомогенізатора без рідкого азоту зверніть увагу на повне попереднє охолодження адаптера гомогенату.

Друга – екзогенна ДНКаза

1.Будьте у повному озброєнні, одягніть лабораторний халат, одягніть маску та обов’язково одягніть пару нових рукавичок (не будьте такими ощадливими!! Слід зазначити, що Тризол надзвичайно корозійний, а також дуже міцний через рукавички, тому не капайте на руки).

2.Усі використані наконечники піпеток, пробірки EP, пробірки для ПЛР та інше обладнання необхідно обробити де-РНКазою.Його можна змочити в 0,1% DEPC, а потім стиснути під високим тиском.Зверніть увагу на роботу у витяжній шафі.Місцеві тирани можуть напряму купувати витратні матеріали для видалення ензимів.

PS: Дозвольте розповісти вам ледачий метод.Хоча висока температура та високий тиск не можуть повністю видалити РНКазу, вони видалять значну її частину.2 рази високої температури та високого тиску мають хороший ефект, а екстракція РНК мало впливає.

3.Алкоголь може денатурувати білки,тому стіл для виділення РНК можна протерти 75% спиртом , а рукавички також можна збризнути спиртом.

4.Остаточний розчин для розчинення РНК і центрифужну пробірку також слід обробити де-РНКазою.DEPC-вода є загальновживаним розчином для розчинення РНК.Давайте поговоримо про правильний метод приготування води DEPC (не забувайте переупакувати комерційну DEPC, коли купуєте її)

Додайте DEPC до надчистої води у співвідношенні 1:1000, добре струсіть, залиште на ніч при 37°C і стерилізуйте при 121°C при високій температурі та високому тиску протягом 15 хвилин.Воду DEPC можна зберігати при -20°C в аліквотах по 1 мл.

Нарешті, підсумовуючи: низька температура - це ключ, витратні матеріали добре обробляються, у повному озброєнні та менше розмов!

Ну ось і все щодо сьогоднішньої стратегії.Я бажаю вам концентрації та чистоти РНК, про які ви згадали.Обидва A260/A280 2.0!!!

Звичайно, якщо ви використовуєте aНабір для екстракції РНК при кімнатній температурі, ви можете не зіткнутися з вищезазначеними проблемами.

Робота при кімнатній температурі, без додавання ДНКази, екстрагує загальну РНК із клітин за 11 хвилин, а загальну РНК із тканин тварин або рослин – за 30 хвилин.

Щоб отримати пробні зразки, звертайтесь:overseas@foregene.com

Супутні товари:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/