Традиційні зворотні транскриптази не витримують високих температур (оптимальна температура для активності MMLV — 37-50°C, а AMV — 42-60°C).Більш складна вірусна РНК не може бути ефективно зворотно транскрибована в кДНК при низьких температурах, що призводить до зниження ефективності виявлення.Традиційна RT-qPCR зазвичай вимагає участі двох ключових ферментів (зворотної транскриптази та ДНК-полімерази), що унеможливлює спрощення роботи реакційної системи та здешевлення.Тут ми представимо дві стійкі до високих температур зворотні транскриптази, TtH і RevTaq.Ці два ферменти також виконують функцію ДНК-полімерази, тому їх називають біфункціональними ферментами.

TtH ДНК-полімераза

Ви напевно чули про TtH, який отримують з термофільної бактерії Thermus thermophilus HB8.У присутності двовалентних катіонів, таких як Mg2+, він має активність ДНК-полімерази.Він широко використовується в реакціях ПЛР, як ензим Taq, але він має вищу термостійкість, ніж ензим Taq, тому він також має кращий ефект при ПЛР з матрицями з високим вмістом GC.

· Цей фермент в основному не має 3′→5′ екзонуклеазної активності та 5′→3′ екзонуклеазної активності, тому його також можна використовувати для дидезоксисеквенування.

· Цей фермент має активність RTase.У присутності Mn2+ активність RTase буде посилена.Використовуючи цю функцію, його можна використовувати для проведення реакції зворотної транскрипції та реакції ПЛР в одній пробірці, тобто одноетапної RT-PCR.Однак у присутності Mn2+ точність RT-PCR не висока.Активність RT не має нічого спільного з активністю РНКази Н.

· Підвищена активність Tth-ДНК-полімерази (pH9, оптимум +55℃～+70℃, максимум +95℃) долає проблеми, викликані вторинною структурою РНК.Отриману кДНК можна ампліфікувати методом ПЛР з тим же ферментом у присутності іонів Mg2+.

· Здатність Tth-ДНК-полімерази здійснювати зворотну транскрипцію та ампліфікацію ДНК при високих температурах робить цей фермент корисним для кількісної RT-PCR, клонування та аналізу експресії генів клітинної та вірусної РНК.
· Tth-ДНК-полімераза використовується для RT-PCR для ампліфікації РНК до 1kb.

Особливості та переваги

Т-я ДНК-полімераза:

• Забезпечте оптимізований розмір продукту полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) принаймні 1000 bp у реакції ЗТ-ПЛР

• В якості субстрату прийняти модифікований дезоксирибонуклеозидтрифосфат

• Не пов'язаний з активністю РНКази H

• Має високу термічну стабільність для подолання проблем, зазвичай пов'язаних із високою вторинною структурою, присутньою в РНК

RevTaq RT-PCR ДНК-полімераза

Термостійка ДНК-полімераза з активністю зворотної транскриптази

RevTaq-RT-PCR-ДНК-полімераза — це сконструйований, високотермостійкий, подвійний функціональний фермент із зворотною транскриптазою та ДНК-полімеразою, отриманий шляхом спрямованої та штучної еволюції.

· Період напіврозпаду ДНК-полімерази RevTaq RT-PCR при 95°C перевищує 40 хвилин.

· RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq je na jess je na dan-2018-2019

· RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PCR RevTaq RT-PLRЦе також сприяє реакції зворотної транскрипції при високих температурах, тим самим зводячи до мінімуму проблеми, що виникають при плавленні сильної вторинної структури РНК при високих температурах.

· Завдяки формулі гарячого старту на основі аптамерів ДНК-полімераза RevTaq RT-PCR дасть кращі результати, коли температура відпалу та розтягування буде вищою за 57°C.

· Оскільки фермент є термостійким, рекомендується розробляти праймери та зонди з дуже високими температурами плавлення (>60°C).

· Рекомендується оптимізувати температуру етапу відпалу/подовження через температурний градієнт під час процесу налаштування реакції.

· Чим вища температура, тим вища специфічність ПЛР.Цикл зворотної транскрипції зазвичай виконується при вищій температурі, ніж цикл ПЛР, оскільки гібридизація ДНК-праймер: шаблон РНК зазвичай має вищу температуру плавлення, ніж дуплекс ДНК-праймер: шаблон кДНК.

· ДНК-полімераза RevTaq RT-PCR розроблена методами генної інженерії та оптимізована, а розмір амплікону становить 60-300 bp.

Межа виявлення ДНК-полімерази RevTaq RT-PCR досягає 4 копій/

Оптимізована реакційна система (встановлення праймерів з високою температурою плавлення) показана на малюнку.RevTaq RT-PCR, керована ДНК-полімеразою, показує кращу чутливість, ніж TaqPath 1-stage RT-qPCR master mix, і нижчий градієнт розведення зразка для виявлення.

Більше переваг:

Функція швидкого запуску → Початковий етап термічної денатурації можна пропустити.

Формула аптамера гарячого старту → Негайно забезпечує 100% активність ферменту та запобігає неспецифічній ампліфікації при низьких температурах (<57°C).

Функція розщеплення → Етап екстракції РНК опущено, оскільки ДНК-полімераза RevTaq RT-PCR також може обробляти необроблені зразки реакції.Він може негайно руйнувати клітинні мембрани еукаріотів, бактерій і вірусів у гарячому циклі RT-PCR.

IVD рівень сировини → високі стандарти якості та надзвичайно конкурентні ціни