Поради щодо покращення відновлення клею

1. Збільште навантаження зразка під час електрофорезу.

2. Використовуйте свіжоприготований буфер для електрофорезу.

3. Під час різання клею намагайтеся різати лише клей смужками, щоб зменшити об’єм різання клею: не потрібен клей із невеликою кількістю фрагментів, інакше це вплине на швидкість відновлення.

4. Розплавивши два або більше шматочків клею, використовуйте пробірку, незалежно від того, наскільки вона велика, і перенесіть її в ту саму колонку.

5. Розчин, доданий у золь, може бути трохи більшим, що більше сприяє зв’язуванню ДНК з мембраною, але зазвичай не перевищує 750 мкл.

6. Ключем до відновлення гелю є зв’язування ДНК із колонкою через концентрацію солі, кислотність (заряд) і гідрофобність розчину в колонці.Тому, якщо рН буфера для електрофорезу занадто високий, 10 мкл (рН 5,0, 3 моль/л NaAC) можна додати до золю;щоб краще перехоплювати молекули ДНК на мембрані, можна додати 30% ізопропанол для нагрівання в рідину після розчинення клею.

7. Перед додаванням елюенту залиште колонку при кімнатній температурі на кілька хвилин (приблизно 10 хвилин), щоб повністю випарувати етанол.

8. Нарешті, додайте менше елюенту, щоб мінімізувати обсяг відновлення.Зазвичай для елюції використовується 30-50 мкл елюенту (не надто мало, інакше він не зможе змочити мембрану, що не сприяє елюції);краплі елюції знаходяться в центрі мембрани, щоб повністю елюювати ДНК, зв’язану з мембраною.

9. Після додавання елюенту його можна елюювати на водяній бані 55 градусів протягом 5 хвилин або помістити у водяну баню 50 градусів більше ніж на 10 хвилин, або закрити парафільмом при 4 градусах на ніч, а потім центрифугувати для відновлення наступного дня, ефект хороший.

10. Додайте відцентрифугований елюат назад до адсорбційної колонки та знову відцентрифугуйте.

Детальні методи та процедури відновлення продукту ПЛР

1. Переробка звичайної гуми

Якщо ви хочете відновити клей, найкраще використовувати набір, який зручний і має трохи більший коефіцієнт відновлення.Якщо вам дійсно потрібно відновити його вручну, ви можете додати 3-кратний об’єм TE після розрізання клею.Після плавлення на водяній бані фенол, фенол/хлороформ чисто екстрагують, а етанол випадає в осад.Це воно.

2. Відновлення ДНК з гелів з низькою температурою плавлення

Очищення фрагментів ДНК. Додайте ТЕ (10 ммоль/л трис-HCl рН8,0, 0,1 ммоль/л EDTA), що дорівнює об’єму гелю, і помістіть у водяну баню при 65°C на 5 хвилин для повного розчинення гелю.

Після доведення до кімнатної температури додавали рівну кількість фенолу (насиченого ТЕ, ТЕ запечатували у верхньому шарі, а нижній шар фенолу видаляли), суміш обережно перемішували (змішування не потрібне) і центрифугували при 12000 об/хв протягом 3 хвилин.Повторити 1-2 рази.

Візьміть супернатант, додайте 0,1 об’єму 3 моль/л ацетату натрію (pH 5,2) і 2,5-кратний об’єм абсолютного етанолу, щоб провести осадження етанолом.Розчиніть очищену ДНК у відповідній кількості TE, виміряйте вміст і підготуйте до використання (її можна використовувати для аналізу структури цільового гена, підготовки зонда тощо).

3. ПЛР-відновлення з хорошою специфічністю ампліфікації

Якщо специфічність ПЛР-ампліфікації хороша, це лише просте очищення та відновлення продукту ПЛР.Ви можете додати 50 мкг/мл протеїнази K до продукту ПЛР, 37 градусів протягом 1 години, екстрагувати один раз фенолом/хлороформом, екстрагувати один раз хлороформом і додати 0,1 об’єму супернатанту.Ацетат натрію виділяли осадженням 2,5 об'ємами абсолютного етанолу.

Супутні товари:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/