Нещодавно я виявив щось дивовижне!Багато досвідчених експериментаторів навколо нього навіть не знають деяких елементарних експериментальних знань.

Наприклад, чи можете ви відповісти на такі запитання?

Чи є різниця між OD260 і A260?Що означає кожна з них?
OD — це абревіатура оптичної щільності (оптична щільність), A — це абревіатура абсорбції (поглинання), ці два поняття насправді однакові, «оптична щільність» — це «поглинання», але «оптична щільність» відповідає більшості національних стандартів і є більш стандартизованою.

Зазвичай ми вимірюємо значення OD при 260 нм, щоб обчислити концентрацію нуклеїнової кислоти, тож що означає 1OD?
Нуклеїнова кислота має максимальний пік поглинання на довжині хвилі 260 нм, який містить як ДНК, так і РНК, а також фрагментовані фрагменти нуклеїнової кислоти (це ключовий момент).
Значення OD, виміряне при довжині хвилі 260 нм, було записане як OD260.Якщо зразок чистий, значення OD260 може розрахувати концентрацію зразка нуклеїнової кислоти.
1 OD260=50 мкг/мл дцДНК (дволанцюгова ДНК)
=37 мкг/мл оцДНК (одноланцюгова ДНК)
=40 мкг/мл РНК
=30 мкг/мл dNTP (олігонуклеотиди)
Чи є зв’язок і різниця між RT-PCR, Realtime-PCR і QPCR?
RT-PCR є скороченням від Reverse Transcription PCR
Real Time PCR=qPCR, скорочення від Quantitative Real Time PCR
Хоча ПЛР у реальному часі (флуоресцентна кількісна ПЛР у реальному часі) і ПЛР зі зворотною транскрипцією (ПЛР зі зворотною транскрипцією) обидві, здається, скорочено називають ЗТ-ПЛР.Але міжнародна конвенція така: RT-PCR конкретно стосується ПЛР зі зворотною транскрипцією.

Які зазвичай використовуються nt, bp і kb для опису довжини ДНК/РНК у біології?
nt = нуклеотид
bp = пара основ пара основ
kb = кілобаза

Звичайно, ви б сказали, що багатьом людям байдужі ці дрібниці!Всі так роблять, і ніхто не запитає, що це таке.Ви знаєте, що це непотрібно, чи не так?

Ні, ні, ні, це дуже потрібно знати!через що?
Тому що ви хочете опублікувати статтю!Брате!Незалежно від того, прагнете ви закінчити навчання чи прагнете до науково-дослідних досягнень, ви повинні покладатися на статті, щоб говорити!

Екстракція нуклеїнової кислоти повинна бути найпростішим і основним експериментом.Якість виділення нуклеїнової кислоти безпосередньо визначає результати подальших дослідів.

Хоча я говорив це багато разів, все ще є багато друзів, яким це байдуже.Цього разу я вирішив вийти зі статті!

Мінімальна інформація для публікації кількісних експериментів ПЛР у реальному часі, що називається MIQE, це набір рекомендацій щодо кількісних експериментів флуоресценції, запроваджених на міжнародному рівні, які пропонують мінімальні стандарти для експериментальної інформації, необхідної для оцінки кількісних експериментів ПЛР із флуоресценцією та публікації статей.За допомогою експериментальних умов і методів аналізу, наданих експериментатором, рецензенти можуть краще оцінити обґрунтованість експериментальної схеми дослідника.

Можна побачити, що в розділі екстракції нуклеїнової кислоти були запропоновані такі елементи виявлення,

«E» вказує на інформацію, яку необхідно надати, а «D» вказує на інформацію, яку слід надати за необхідності.

Форма дуже складна, власне, я хочу сказати, що всім потрібно починати з цього

чистота (D), вихід (D), цілісність (E) і консистенція (E) для оцінки нуклеїнових кислот у цих чотирьох аспектах.

Відповідно до експериментальних звичок, спочатку поговоримо про методи оцінки чистоти та концентрації.

Вимірювання ОП є улюбленим і найпростішим методом виявлення для експериментаторів.Що стосується принципу, я не буду тут вдаватися в подробиці.Зараз багато лабораторій використовують ультра-мікро спектрофотометри для безпосереднього кількісного аналізу зразків нуклеїнових кислот.Відображаючи значення поглинання, програма безпосередньо дає значення концентрації (нуклеїнової кислоти, білка та флуоресцентного барвника) та відповідні співвідношення.Що стосується аналізу значення OD, збережіть це зображення, і все буде добре.

Універсальний список розчинів зі значенням OD

Однак є кілька застережень, які потрібно висвітлити окремо.

(Зрештою, я знаю, що ви повинні бути тими, хто заощаджує і чекає, поки вони вам знадобляться!)

Примітка 1 Обладнання

На величину OD впливає різне обладнання.Поки OD260 знаходиться в межах певного діапазону, значення OD230 і OD280 є значущими.Наприклад, діапазон поглинання звичайного Eppendorf D30 при 260 нм становить 0~3 A, а NanoDrop One від Thermo — при 260 нм.Діапазон поглинання 0,5~62,5A.

Примітка 2Реагент для розведення

На величину ОП може вплинути розведення різних реагентів.Наприклад, показник OD260/280 очищеної РНК у pH7,5 10 мМ Трисбуфер між 1,9-2,1, а внейтральний водний розчинспіввідношення буде нижчим, можливо, лише 1,8-2,0, але це не означає, що якість РНК змінюється Різниця.

Примітка 3Залишкові речовини

Наявність залишкових речовин впливатиме на точність вимірювання концентрації нуклеїнових кислот, тому необхідно якомога більше уникати залишків білків, фенолів, полісахаридів і поліфенолів у зразках нуклеїнових кислот.

Однак насправді екстракція органічними реагентами є старим методом.У комерційних наборах ефект екстракції може бути досягнутий за допомогою адсорбційної колонки на основі кремнезему в поєднанні з центрифугуванням, уникаючи токсичних і шкідливих органічних реагентів, які важко видалити, тощо. Проблема, така якНабір для екстракції нуклеїнової кислоти від Foregene не використовує ДНКазу/РНКазу та токсичні органічні реагенти під час операції, швидко та безпечно, іефект єдобре(випадково сказав, що він лисий, але я знаю, що ви хочете знати).

Приклад 1: Вихід і чистота екстракції геномної ДНК

Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) обробляє зразки ґрунту з різних джерел, а кількість і чистоту отриманої геномної ДНК показано в наступній таблиці:
Приклад 2: Вихід і чистота екстракції тканинної РНК

Набір для виділення загальної РНК тварин (RE-03012) обробляв різні зразки тканин, кількість і чистоту отриманої РНК наведено в таблиці нижче (для тканини миші):
Однак не думайте, що ви закінчили зі значенням OD.Чи маєте ви подбати про ключові моменти, які я намалював для вас спереду?

Повідомлення

Фрагментовані молекули нуклеїнової кислоти також будуть розраховані в абсорбції.Якщо припустити, що у вас є залишки геномної ДНК у РНК, значення вашої ОП буде дуже високим, але фактичну концентрацію РНК визначити неможливо.Чи є ваша РНК. Незрозуміло, чи відбувається деградація, тому нам все ще потрібен комплексний метод оцінки, щоб дати більш точне судження, тобто оцінка цілісності нуклеїнової кислоти, згадана в MIQE.