Огляд
Швидка ідентифікація трансгенних рослин
Текст/Тун Юйчен
Експериментальна операція / Хань Ін
Редактор/Вень Юцзюнь
Слова/1600+
Рекомендований час читання/8-10 хв
Швидка ідентифікація трансгенних рослин
Новачку в лабораторії не варто відсіювати позитивні рослини з групи рослин із низьким рівнем конверсії.Спочатку з великої кількості зразків один за одним необхідно виділити ДНК, а потім за допомогою ПЛР виявлять чужорідні гени.Однак результати часто пусті, а час від часу смуги з кількома елементами, але неможливо визначити, чи є пропущені виявлення чи помилкові виявлення..Чи дуже безпорадно зіткнутися з таким експериментальним процесом і результатами?Не хвилюйся, брат навчить тебе, як легко й точно відсіювати трансгенні позитивні рослини.
Крок 1: Праймери виявлення дизайну
Визначте ендогенний ген і екзогенний ген, які необхідно виявити, відповідно до зразка, який потрібно перевірити, і виберіть репрезентативну послідовність 100-500 bp в гені для дизайну праймера.Хороші праймери можуть забезпечити точність результатів виявлення та скоротити час виявлення (дивіться додаток для праймерів, які зазвичай використовуються).
Примітка:
Нещодавно розроблені праймери повинні оптимізувати умови реакції та перевірити точність, точність і межу виявлення виявлення перед виконанням великомасштабного виявлення.
Крок 2:Розробіть протокол експерименту
Позитивний контроль: використовуйте очищену ДНК, що містить цільовий фрагмент, як матрицю, щоб визначити, чи система та умови реакції ПЛР є нормальними.
Негативний/порожній контроль: використовуйте шаблон ДНК або ddH2O, який не містить цільового фрагмента як шаблону для визначення наявності джерела забруднення в системі ПЛР.
Внутрішній еталонний контроль: використовуйте комбінацію праймер/зонд ендогенного гена зразка, який потрібно перевірити, щоб оцінити, чи можна виявити матрицю за допомогою ПЛР.
Примітка:
Позитивні, негативні/порожні контролі та внутрішні контрольні контролі повинні бути встановлені для кожного тесту, щоб оцінити достовірність результатів експерименту.
крок 3: Підготовка досліду
Перед використанням перевірте, чи рівномірно змішаний розчин.При виявленні осаду перед використанням його необхідно розчинити і перемішати відповідно до інструкції.Щоб уникнути нерівномірного розподілу іонів, суміш 2 × ПЛР потрібно відпіпетувати та повторно перемішати мікропіпеткою.
Примітка:
Вийміть інструкцію і уважно прочитайте її, а перед дослідом підготуйтеся в суворій відповідності з інструкцією.
Крок 4: Підготуйте реакційну систему ПЛР
Згідно з протоколом експерименту, змішайте праймери H2O, 2×PCR змішайте, відцентрифугуйте та розподіліть їх у кожну реакційну пробірку.
Примітка:
Для широкомасштабного або тривалого тестування рекомендується використовувати реакційну систему ПЛР, що містить фермент UNG, який може ефективно уникнути аерозольного забруднення, викликаного продуктами ПЛР.
Крок 5: Додайте шаблон реакції
Використовуючи технологію Direct PCR, немає потреби у виснажливому процесі очищення нуклеїнових кислот.Шаблон зразка можна підготувати протягом 10 хвилин і додати до відповідної реакційної системи ПЛР.
Примітка:
Метод лізису має кращий ефект виявлення, і отриманий продукт можна використовувати для кількох реакцій виявлення.
5.1: Пряма ПЛР листя
Відповідно до розміру малюнка в посібнику, виріжте тканину листа діаметром 2-3 мм і помістіть її в реакційну систему ПЛР.
Примітка: Переконайтеся, що фрагменти листя повністю занурені в реакційний розчин ПЛР, і не додавайте надмірну кількість тканини листя.
5.2: Метод лізису листя
Відріжте тканину листа діаметром 5-7 мм і помістіть її в центрифужну пробірку.Якщо ви обираєте зріле листя, уникайте використання тканин головної жилки листа.Прокапайте 50 мкл лізату буфера P1 у центрифужну пробірку, щоб переконатися, що лізат може повністю занурити тканину листа, помістіть його в термоциклер або металеву ванну та лізуйте при 95°C протягом 5-10 хвилин.
Додайте 50 мкл нейтралізаційного розчину буфера P2 і добре перемішайте.Отриманий лізат можна використовувати як матрицю та додати до реакційної системи ПЛР.
Примітка: кількість матриці має становити 5-10% від ПЛР-системи і не повинна перевищувати 20% (наприклад, у 20-мкл ПЛР-систему додайте 1-2 мкл буфера для лізису, не більше 4 мкл).
Крок 6: ПЛР-реакція
Після центрифугування пробірки з реакцією ПЛР помістіть їх у прилад для ПЛР для ампліфікації.
Примітка:
У реакції для ампліфікації використовується неочищена матриця, тому кількість циклів ампліфікації на 5-10 більше циклів, ніж при використанні очищеної матриці ДНК.
Крок 7: Виявлення електрофорезу та аналіз результатів
M: сходи ДНК 100 bp
1\4: Метод очищеної ДНК
2\5: Метод прямої ПЛР
3\6: Пустий контроль
Контроль якості:
Результати тестування різних контролів, установлених в експерименті, повинні відповідати наступним умовам.В іншому випадку слід проаналізувати причину проблеми та провести тест знову після усунення проблеми.
Таблиця 1. Нормальні результати тестування різних контрольних груп
*Якщо плазміду використовують як позитивний контроль, результат тесту на ендогенний ген може бути негативним
Судження за результатами:
A. Результат тесту ендогенного гена зразка є негативним, що вказує на те, що ДНК, придатну для звичайного ПЛР-детектування, не може бути вилучено із зразка або вилучена ДНК містить інгібітори реакції ПЛР, і ДНК слід виділити повторно.
B. Результат тесту на ендогенний ген зразка є позитивним, а результат тесту на екзогенний ген є негативним, що вказує на те, що зі зразка виділено ДНК, придатну для звичайного ПЛР-детектування, і можна судити про те, що ген ХХХ у зразку не виявлено.
C. Результат тесту на ендогенний ген зразка є позитивним, а результат тесту на екзогенний ген є позитивним, що вказує на те, що зі зразка було виділено ДНК, придатну для звичайного ПЛР, і ДНК зразка містить ген XXX.Експерименти для підтвердження можуть бути додатково проведені.
Крок 8: Праймери виявлення дизайну
Після експерименту використовуйте 2% розчин гіпохлориту натрію та 70% розчин етанолу, щоб протерти експериментальну зону, щоб запобігти забрудненню навколишнього середовища.
Додаток
Таблиця 2. Зазвичай використовувані праймери для загального виявлення ПЛР генетично модифікованих рослин
Довідковий документ:
SN/T 1202-2010, Метод якісного ПЛР виявлення генетично модифікованих рослинних інгредієнтів у продуктах харчування.
Оголошення Міністерства сільського господарства 1485-5-2010, Тестування інгредієнтів генетично модифікованих рослин і продуктів з них - рис M12 і його похідні.
Час публікації: 09 червня 2021 р
