Усі говорять про принцип експерименту qRT-PCR, дизайн праймерів, інтерпретацію результатів тощо, але я думаю, що я повинен поділитися з вами експериментальною роботою qRT-PCR.Це мало, але це стосується результатів.
Перш ніж робити qRT-PCR, ми повинні мати чітке розуміння нашої власної РНК і методів роботи.Адже наші зусилля спрямовані на отримання результату, а не просто на практику.Отже, перш ніж робити qRT-PCR, нам потрібно визначити наступні проблеми (деякі з яких застосовні лише до SYBR).
1 Ви впевнені, що ваша РНК не деградувала?
NanoDrop 2000 може лише визначити концентрацію та чистоту РНК, але не може визначити цілісність РНК.
Значення РНК (число інтенсивності РНК) може відображати цілісність РНК, яка визначається системою біоаналізатора Agilent 2100.
Рис. Схематична діаграма значень RIN для різних зразків РНК (еукаріоти)
Проте лабораторії зазвичай не мають біоаналізатора Agilent 2100.У цьому випадку ми можемо виявити через формальдегідний гель, але вимога до загальної кількості РНК висока, тому найшвидшим методом є використання звичайного гель-електрофорезу.Необхідно перебувати в середовищі без нуклеаз, тому необхідно промити резервуар для електрофорезу, флакон з золем, дужку з гелем і гребінець водою DEPC.Агароза також не містить нуклеази (за умови, що вона щойно відкрита), а буфер для завантаження має бути якомога свіжішим із 1,2% гелю.
Зверніть увагу, що гель повинен бути повністю розчинений, інакше він спричинить неоднорідні смуги, як показано у зразку 9 на малюнку.Якщо напруга занадто висока або працює надто довго, це призведе до виділення тепла та спричинить деградацію РНК, тому напругу та час слід розумно контролювати.Крім того, за допомогою гелю можна додатково визначити, чи є в зразку залишок ДНК, і спостерігати, чи є велика кількість утриманих смуг у розподільній лунці.
малюнок.Виявлення РНК методом гель-електрофорезу
2 Ви впевнені щодо концентрації вашої кДНК?
Досвід старших братів у лабораторії свідчить про те, що кДНК системи 20 мкл, отриманої кожною інверсією, безпосередньо розбавляють у 20 разів, тоді як сестри з постдокторантом розводять у 10 разів.Зазвичай я залежу від ситуації.Оскільки якість РНК, згадана кожною особою, різна, рівень реверсії також різний, і технологія реверсії може бути нестабільною.
Тож кожного разу, коли я отримую зворотну кДНК, я спочатку розводжу її приблизно в 3 рази, а потім використовую ген господарювання для проведення RT-PCR, кількість циклів зазвичай становить 25 циклів, щоб визначити конкретну концентрацію, а потім визначаю остаточний коефіцієнт розведення.
3 Ви впевнені, що ваші праймери прості у використанні?
Він може пройти криву плавлення qRT-PCR, але це все одно коштує грошей.Для лабораторій без великих грошей, коли вони отримують багато праймерів, вони можуть використовувати звичайну RT-PCR, щоб побачити, чи це одна смуга, і визначити специфічність праймерів.Якщо в лабораторії немає грошей, то специфічність усіх праймерів можна одноразово визначити за кривою плавлення.
4 Ви впевнені, що ваші експериментальні умови підходять?
SYBR слід захищати від сильного світла, тому спробуйте вимкнути верхнє світло під час додавання реагенту SYBR і використовувати лише тьмяне світло, щоб завершити це.
Зберігайте SYBR при 4°C.Під час використання обережно перевертайте вгору та вниз, щоб добре перемішати, щоб уникнути утворення піни, і не струшуйте сильно.
Деякі молодші сестри люблять малювати позначки на дошці ПЛР, боячись переплутати зразки, що неправильно.Оскільки ваші маркери дуже ймовірно впливатимуть на збір флуоресцентних сигналів, я загалом рекомендую учням молодших класів використовувати експериментальні блокноти, щоб допомогти запам’ятати, як показано нижче.
малюнок.Діаграма завантаження зразка qRT-PCR
5 Ви впевнені, що робите це правильно?
Обов’язково в рукавицях, в рукавичках, в рукавичках, тричі кажи важливі речі.
Щоб зменшити вплив світла на SYBR, я особисто хочу спочатку додати шаблон, як показано на малюнку нижче.Згідно з досвідом, додавання невеликої кількості шаблону може спричинити помилки вибірки.Тому, щоб мінімізувати помилку, спричинену додаванням невеликої кількості шаблону, я зазвичай знову подвоюю зразок і подвоюю кількість під час додавання зразка, щоб зменшити кількість доданої H2O2.
малюнок.Принципова схема завантаження qRT-PCR
Потім налаштуйте систему qRT-PCR наступним чином.
малюнок.Схема підготовки системи qRT-PCR
ПРИМІТКА. Процес конфігурації потрібно виконувати на льоду.
Після додавання зразка наклейте прозору плівку.Намагайтеся не торкатися до поверхні прозорої герметизуючої плівки руками, просто діють з простору з обох сторін плівки.Оскільки відбитки пальців також можуть впливати на збір флуоресцентних сигналів.Потім використовуйте центрифугу для швидкого центрифугування протягом 10 с на низькій швидкості, щоб запобігти звисанню зразка на стіні.
Супутні товари:
Час публікації: 28 квітня 2023 р
