COVID-19 — це інфекційне захворювання, спричинене коронавірусом типу 2 із важким гострим респіраторним синдромом. Коли людина заражена, найпоширенішими симптомами є лихоманка, кашель і задишка.

Зразки, які використовуються для тестування, можуть бути зібрані за допомогою мазків з носоглотки або ротоглотки.

Що таке ПЛР?

Стандартним методом виявлення коронавірусу є полімеразна ланцюгова реакція, ПЛР.Це метод, який широко використовується в молекулярній біології.Він може швидко копіювати від мільйонів до мільярдів конкретних фрагментів ДНК.

Новий коронавірус містить дуже довгий одноланцюговий геном РНК.Щоб виявити ці віруси за допомогою ПЛР, молекули РНК повинні бути перетворені в комплементарні послідовності ДНК за допомогою зворотної транскриптази, а потім новосинтезовану ДНК можна ампліфікувати за допомогою стандартних процедур ПЛР, які широко відомі як ЗТ-ПЛР.

процес RT-PCR

екстракція РНК

Для виконання цього методу необхідно виділити РНК вірусу.Для зручного, швидкого та ефективного розділення можна використовувати різні набори для очищення РНК.

Щоб виділити вірусну РНК за допомогою комерційного набору, спочатку додайте зразок у мікроцентрифужну пробірку, а потім змішайте його з буфером для лізису.Цей буфер є високоденатурованим і зазвичай складається з фенолу та гуанідинізотіоціанату.Крім того, інгібітори РНКази зазвичай присутні в буфері лізису для забезпечення ізоляції інтактної вірусної РНК.

Після додавання буфера для лізису збовтайте пробірку для змішування імпульсом та інкубуйте при кімнатній температурі.Потім вірус лізується в умовах високої денатурації, що забезпечуються буфером для лізису.

Після лізування зразка центрифужна пробірка використовується для процедури очищення.Зразок завантажують у центрифужну пробірку, а потім центрифугують.

Ця процедура є методом твердофазної екстракції, у якому нерухома фаза складається з матриці силікагелю.

За оптимальних умов солі та pH молекули РНК зв’язуються з кремнеземною мембраною.

Одночасно видаляється білок та інші забруднення.

Після центрифугування помістіть центрифужну пробірку в чисту пробірку для збору, видаліть фільтрат, а потім додайте промивний буфер.

Знову помістіть пробірку в центрифугу, щоб промивний буфер пройшов через мембрану.Це видалить усі залишки домішок із мембрани, залишивши лише РНК, зв’язану з силікагелем.

Після промивання зразка помістіть пробірку в чисту мікроцентрифужну пробірку та додайте буфер для елюювання.

Потім його центрифугують, щоб проштовхнути буфер для елюції через мембрану.Буфер для елюції видаляє вірусну РНК із спінової колонки та отримує очищену РНК, вільну від білків, інгібіторів та інших забруднень.

КРОК 2

Змішаний концентрат

Після виділення вірусної РНК наступним етапом є приготування реакційної суміші для ПЛР-ампліфікації.На цьому етапі використовується концентрат.Цей концентрований розчин є попередньо змішаним концентрованим розчином, що складається з преміксу, зворотної транскриптази, нуклеотидів, прямого праймера, зворотного праймера, зонда TaqMan і ДНК-полімерази.

Нарешті, щоб завершити цю реакційну суміш, додається матриця РНК.Пробірки змішують за допомогою імпульсного вортексу, а потім реакційну суміш завантажують у планшет для ПЛР.Планшет для ПЛР зазвичай містить 96 лунок і може аналізувати декілька зразків одночасно.

КРОК 3

ПЛР-ампліфікація

Потім помістіть планшет у ПЛР-апарат, який, по суті, є термоциклером.

RT-PCR у реальному часі використовується для виявлення нового коронавірусу 2019 шляхом ампліфікації цільової послідовності в гені RdrRP, гені E та гені N.Вибір цільового гена залежить від послідовності праймера та зонда.

Першим кроком RT-PCR є зворотна транскрипція.Синтезується перший ланцюг комплементарної ДНК, який ініціюється зворотним праймером ПЛР, який зв’язується з комплементарною частиною генома вірусної РНК.Потім зворотна транскриптаза додає нуклеотиди ДНК до 3'-кінця праймера для синтезу ДНК, комплементарної вірусній РНК.Температура та тривалість цього етапу залежать від використовуваних праймерів, цільової РНК і зворотної транскриптази.

Далі застосовується початкова стадія денатурації, яка призводить до денатурації гібриду РНК-ДНК.Цей крок необхідний для активації ДНК-полімерази.При цьому відбувається інактивація зворотної транскриптази.

ПЛР складається з серії термічних циклів.Кожен цикл складається зі стадій денатурації, відпалу та розширення.

Етап денатурації включає нагрівання реакційної камери до 95 градусів за Цельсієм і використання її для денатурації матриці дволанцюгової ДНК.

На наступному етапі температура реакції знижується до 58 градусів за Цельсієм, дозволяючи прямому праймеру відпалюватися з комплементарною частиною його одноланцюгової матриці ДНК.Температура відпалу безпосередньо залежить від довжини і складу праймера.

На етапі подовження ДНК-полімераза синтезує новий ланцюг ДНК, який є комплементарним до матричного ланцюга ДНК.Шляхом додавання вільних ядер, комплементарних матриці, у напрямку від 5′ до 3′ від реакційної суміші.Температура цього етапу залежить від використовуваної ДНК-полімерази.

Після першого циклу виходить дволанцюгова ДНК-мішень.

Потім увійдіть у другий цикл.Дволанцюгова ДНК денатурується з утворенням двох одноланцюгових молекул ДНК.

На наступному етапі температура реакції знижується, праймери відпалюються до кожної одноланцюгової матриці ДНК, а зонд Taq-man відпалюється до комплементарної частини цільової ДНК.

Зонд TaqMan складається з флуорофора, ковалентно зв’язаного з 5′-кінцем олігонуклеотидного зонда.При збудженні джерелом світла циклера флуорофор випромінює флуоресценцію.Крім того, зонд складається з гасника на 3′-кінці.Близькість репортерного гена до гасника перешкоджає виявленню флуоресценції.

На етапі подовження ДНК-полімераза синтезує новий ланцюг.Коли полімераза досягає зонда TaqMan, його ендогенна 5′-нуклеазна активність розщеплює зонд, відокремлюючи барвник від гасника.

З кожним циклом ПЛР вивільняється більше молекул барвника, що призводить до збільшення інтенсивності флуоресценції, пропорційного кількості синтезованих ампліконів.

Цей метод дозволяє оцінити кількість даної послідовності, присутньої у зразку.У кожному циклі кількість дволанцюгових фрагментів ДНК подвоюється.Тому ПЛР можна використовувати для аналізу дуже малих зразків.

Для вимірювання флуоресцентного сигналу, вольфрамової галогенної лампи, фільтра збудження, рефлектора, лінзи, емісійного фільтра та пристрою із зарядовим зв’язком використовуйте ПЗЗ-камеру.

КРОК 4 Виявлення

Для вимірювання флуоресцентного сигналу, вольфрамової галогенної лампи, фільтра збудження, рефлектора, лінзи, емісійного фільтра та пристрою із зарядовим зв’язком використовуйте ПЗЗ-камеру.

Відфільтроване світло від лампи відбивається рефлектором, проходить через збиральну лінзу і фокусується в центр кожного отвору.Потім флуоресценція, що випромінюється з отвору, відбивається від дзеркала, проходить через емісійний фільтр і реєструється ПЗЗ-камерою.У кожному циклі ПЛР світло флуорофора, що самозбуджується, може бути виявлено CCD.

Він перетворює захоплене світло в цифрові дані.Цей метод називається ПЛР у реальному часі, і він дозволяє в режимі реального часу відстежувати перебіг ПЛР-реакції.