ПЛР, багаторазовий ПЛР, ПЛР in situ, Зворотна ПЛР, ОТ-ПЛР, qPCR（1）–ПЛР

Ⅰ. ПЛР

Полімеразна ланцюгова реакція, яка називається ПЛР, — це молекулярно-біологічна технологія, яка використовується для збільшення певних фрагментів ДНК.Це можна розглядати як особливу реплікацію ДНК in vitro.Ферменти, які використовуються сьогодні (так звані полімераза Taq), були виділені з Thermus aquaticus, бактерії гарячого джерела в 1976 році. Його характеристика полягає в тому, що він може протистояти високій температурі та є ідеальним ферментом, але він широко використовується після 1980-х років.Оригінальна концепція оригінального примітивного прототипу ПЛР схожа на репарацію та копіювання генів, яку запропонував доктор Джелл Клеппе в 1971 році. Він опублікував першу просту та короткочасну копію гена (подібну до реакцій перших двох циклів ПЛР).ПЛР, розроблений сьогодні, був розроблений доктором Кері Б. Маллісом у 1983 році. Того року доктор Мулліс обслуговував PE компанії, тому PE має особливий статус у галузі ПЛР.Доктор Мулліс офіційно опублікував першу пов’язану статтю разом із Сайкі та іншими в 1985 році. З тих пір використання ПЛР проходить тисячі миль на день, і можна сказати, що якість пов’язаних статей робить багато інших методів дослідження неприємними.Згодом технологія ПЛР широко використовується в біологічних наукових дослідженнях і клінічних застосуваннях, ставши найважливішою технологією досліджень молекулярної біології.

ПЛРПринцип

Основний принцип технології ПЛР подібний до природного процесу реплікації ДНК, і його специфічність залежить від олігонуклеотидного праймера, який комплементарний обом кінцям цільової послідовності.ПЛР складається з трьох основних етапів реакції дегенерації-відпалу-подовження: ①Дегенерація матричної ДНК: після нагрівання матричної ДНК до приблизно 93°C протягом певного періоду часу розчин подвійної ДНК для подвійної ланцюгової ДНК, утворений шляхом ПЛР-ампліфікації матричної ДНК, виходить, перетворює його в єдиний ланцюг, щоб його можна було поєднати з праймером для підготовки до наступної раундової реакції.②Відпал (сполука) матричної ДНК і праймера: після нагрівання матричної ДНК і її дегенерації в один ланцюг температура падає приблизно до 55°C.③Розширення праймера: матриця ДНК - зв'язування праймера базується на дії TaqDNA-полімерази з dNTP як вихідним матеріалом реакції.Зберігайте принцип реплікації, синтезуйте новий напівзарезервований ланцюг копіювання, який доповнює шаблонний ланцюг ДНК, і повторюйте три процеси циклу виродження-відпал-розширення, щоб отримати більше «напівзарезервованого ланцюга копіювання», і цей новий ланцюг знову доступний. Станьте шаблоном для наступного циклу.

СтандартнийПЛРСистема реагування

П'ять елементів ПЛР-реакції

Існує в основному п’ять видів речовин, які беруть участь у реакції ПЛР, а саме праймер, фермент, dNTP, матриця та буфер (необхідний Mg2+).[Процедура ПЛР]

1. Дегенерація ДНК (90°C-96°C): дволанцюгові матриці ДНК під дією тепла розривають водневі зв’язки, утворюючи одноланцюгову ДНК.

2. Відпал (25 ℃ -65 ℃): температура системи знижується, праймер поєднується з шаблоном ДНК для формування локальної подвійної ланцюга.

3. Подовження (70 ℃ -75 ℃): під дією ферменту Taq (приблизно 72 °C, найкраща активність) dNTP використовується як вихідний матеріал, простягається від 5'-кінця праймера до 3'-кінця, синтез і матриця доповнюють один одного ланцюга ДНК.

Кожен цикл денатурується, відпалюється і подовжується, подвоюючи вміст ДНК.В даний час через коротку область ампліфікації деякі ПЛР можна відтворити за дуже короткий час, навіть якщо активність ферменту Taq не є оптимальною, тому її можна змінити на два етапи, тобто відпал і подовження можна виконувати при 60°C-65°C одночасно.Щоб зменшити процес підйому та охолодження та покращити швидкість реакції.

Особливості ПЛР-реакції

● Висока специфічність

Конкретними вирішальними факторами відповіді ПЛР є: ①Специфічна комбінація праймера та матричної ДНК.②Принцип парування основ.③Вірність реакції синтезу полімерази TaqDNA.④Специфічність і консервативність цільового гена.

Зв'язування праймера з матрицею і подовження ланцюга праймера засновані на принципі узгодження лужної основи.Лояльність реакцій синтезу полімерази та високої температури стійкості до полімерази ДНК Taq для того, щоб зв'язати (з'єднання) шаблону та ґрунтовки в реакції можна виконати при більш високій температурі.Специфічність поєднання значно підвищується.Кліп може підтримувати високу ступінь коректності.Вибираючи цільову генетичну область з високою консервативністю та високою консервативністю, її специфічність вища.

● Висока чутливість

Обсяг виробництва продуктів ПЛР збільшується на індекс, який може розширити стартовий шаблон Пікера (PG=10-12) для підвищення рівня мікроконтролера до рівня мікрограмів (мкг= -6).Цільові клітини можуть бути виявлені з 1 мільйона клітин;при виявленні вірусів чутливість ПЛР може досягати 3 RFU (пусті плями утворюють одиниці);мінімальний рівень виявлення в бактеріології становить 3 бактерії.

Зазвичай реакція ампліфікації завершується через 2-4 години.Доповнені продукти, як правило, аналізуються електричним мечем і не потребують використання ізотопів, радіоактивного забруднення та легкого просування.

● Чистота зразка низька

Немає необхідності відокремлювати віруси або бактерії та клітини культури.Сирі продукти ДНК та РНК можуть використовуватися як підсилювачі.Виявлення ампліфікації ДНК можна використовувати безпосередньо за допомогою клінічних зразків, таких як кров, рідина тіла, рідина для промивання кашель, волосся, клітини та жива тканина.

ПЛР

● Хибно негативний результат, відсутність посилених смуг

Ключові етапи реакції ПЛР включають: ① приготування нуклеїнових кислот матриці, ② якість і специфічність праймерів, ③ якість ферментів ④ умови циклу ПЛР.Пошук причини також слід проаналізувати та вивчити за посиланнями вище.

Шаблони: ① Шаблон містить різний білок, ② Шаблон містить інгібітор ферменту Taq, ③ Білок у шаблоні не видаляється, особливо груповий білок у хромосомі.⑤ Дегенерація нуклеїнової кислоти демінера не є повною.Якщо якість ферментів і праймерів хороша, немає смуги ампліфікації, що, швидше за все, є результатом травної обробки зразків.Щось не так із процесом екстракції нуклеїнової кислоти шаблону, тому, щоб підготувати ефективний і стабільний розчин для розщеплення, його процедуру слід фіксувати, а не змінювати довільно.

Інактивація ферменту: новий фермент або обидва старі та нові ферменти слід використовувати разом, щоб проаналізувати, чи активність ферменту втрачена або недостатня, що призводить до помилкових негативних результатів.Слід зазначити, що іноді забувають про фермент Taq або бромід етидію.

Праймер: якість праймера, концентрація праймера та чи є концентрація двох праймерів симетричною.Це поширена причина невдачі ПЛР або збільшення смуги не є ідеальним і схильне до дифузії.Є проблеми з якістю праймерів деяких партій.Два праймери мають високу та низьку концентрацію, що спричиняє низькоефективну асиметричну ампліфікацію.Контрзаходи такі: ① Виберіть хороший праймер для синтезу одиниць.Повинна бути зона праймерної смуги, а яскравість двох праймерів має бути однаковою.Belt, ПЛР може дати збій у цей час, і це слід вирішити за допомогою блоку синтезу праймерів.

Концентрація Mg2+: концентрація іонів Mg2+ має великий вплив на ефективність ампліфікації ПЛР.Надмірна концентрація може зменшити протилежну стать ПЛР-ампліфікації.Якщо концентрація надто низька, результат ПЛР-ампліфікації призведе до невдачі ПЛР-ампліфікації без смуги розширення.

Зміна об’єму реакції: об’єм, який використовується для ПЛР-ампліфікації, становить 20 мкл, 30 мкл і 50 мкл або 100 мкл, великий об’єм програми для ПЛР-ампліфікації встановлюється відповідно до різних цілей наукових досліджень і клінічних випробувань.Після виготовлення невеликих об’ємів, таких як 20 мкл, необхідно зробити стан шнура під час виготовлення розміру, інакше він вийде з ладу.

Фізичні причини: трансформація дуже важлива для ПЛР-ампліфікації.занадто низька температура відпалу може спричинити неспецифічне посилення та знизити ефективність специфічного посилення.Іноді необхідно використовувати стандартні термометри для виявлення мінливості, відпалу та розширеної температури в плиті з розширенням або водою, що є однією з причин відмови ПЛР.

Варіанти цільової послідовності: якщо виникає цільова послідовність, мутація або делеція, комбінація прототипу та матриці поєднується, або через відсутність цільової послідовності праймер і матриця втратять комплементарну послідовність, і їх ПЛР-ампліфікація не буде успішною.

● Хибний позитивний результат

Діапазон ампліфікації ПЛР з'являється узгоджено з діапазоном цільової послідовності, а іноді його смуга більш акуратна і вища.

Якщо це необхідно, перед додаванням зразків реакційна трубка та реагент піддаються впливу ультрафіолетових променів для знищення існуючої нуклеїнової кислоти.По-друге, дрібні фрагменти в забрудненні повітря.Його можна зрощувати один з одним.

● З'являється неспецифічна смуга посилення

По-друге, якість і кількість ферментів.

● З'являється відшарований джгут або пляма стрічки

Ампліфікація ПЛР іноді виявляється нанесеною, обстрілювальною або килимкою.Контрзаходи такі: ①Зменшіть кількість ферментів або змініть фермент з іншого джерела.

Супутні товари

ПЛР Heroᵀᴹ (з барвником)

◮ Вища точність: у 6 разів більше, ніж звичайний фермент Taq;

◮ Швидша швидкість посилення

◮ Більше адаптивності шаблону

◮ Вища ефективність підсилення

◮ Стійкість до навколишнього середовища сильніша: розміщення при 37°C протягом тижня, зберігаючи понад 90% активності;

PCR Easyᵀᴹ (з барвником)

Завдяки унікальній реакційній системі та високоефективній ДНК-полімеразі Taq реакція ПЛР має вищу ефективність ампліфікації, специфічність і чутливість.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

₂O.

◮ Набір використовує унікальний регенерний реагент зворотної транскрипції та передоплетену ДНК -полімеразу Hotstar Taq в поєднанні з унікальною системою реакцій для ефективного підвищення ефективності ампліфікації та специфічності реакції.

◮ Оптимізована реакційна система змушує реакцію мати більш високу чутливість до виявлення, сильнішу термічну стійкість та кращу толерантність.

^TMНабір (One Step)-SYBR Green I поставляється з внутрішнім еталонним барвником ROX, який можна використовувати для усунення фонового сигналу та помилок сигналу між лунками, що зручно для клієнтів у використанні в різних моделях інструментів для кількісної ПЛР.

^TMII  синтез кДНК першого ланцюга для

- Ефективна здатність видаляти гДНК, яка може видалити гДНК у шаблоні протягом 2 хвилин.

-Ефективна система зворотної транскрипції, для завершення синтезу першого ланцюга кДНК потрібно лише 15 хвилин.

-Складні шаблони: шаблони з високим вмістом GC і складною вторинною структурою також можуть бути звернені з високою ефективністю.

-Високочутлива система зворотної транскрипції, шаблони рівня pg також можуть отримати високоякісну кДНК.

-Тея зворотної транскрипції має високу термічну стійкість, оптимальна температура реакції становить 42 ℃, і вона все ще має хороші показники зворотної транскрипції при 50 ℃.