ПЛР є найпоширенішою технологією ампліфікації нуклеїнових кислот і широко використовується завдяки своїй чутливості та специфічності.Однак ПЛР вимагає повторної термічної денатурації і не може позбутися обмежень покладатися на інструменти та обладнання, що обмежує його застосування в клінічних випробуваннях.

З початку 1990-х років багато лабораторій почали розробляти технологію посилення постійної температури, яка не потребує термічної денатурації.Зараз вони розробили технологію ізотермічної ампліфікації, опосередкованої петлею, технологію ізотермічної ампліфікації із заміщенням ланцюга, технологію ізотермічної ампліфікації з рухомим колом і залежність послідовності нуклеїнових кислот.Технологія ізотермічного посилення та інші технології. 

Loop-опосередковане ізотермічне посилення

Принцип ампліфікації заснований на тому факті, що ДНК знаходиться в стані динамічної рівноваги приблизно при 65°C.Коли будь-який праймер має пару основ і продовжується до комплементарної частини дволанцюгової ДНК, інший ланцюг дисоціює і стає одноланцюговим.

При цій температурі ДНК використовує 4 специфічні праймери, щоб спиратися на ДНК-полімеразу із заміщенням ланцюга, щоб забезпечити безперервну самоциркуляцію синтезу ДНК із заміщенням ланцюга.

Спочатку визначте 6 специфічних областей F3, F2, F1, B1, B2, B3 цільового гена, а потім створіть 4 праймери на основі цих 6 конкретних областей (як показано на малюнку нижче):

Передній внутрішній праймер (FIP) складається з F1c і F2.

Зворотний внутрішній праймер (BIP) складається з B1c і B2, а TTTT використовується як спейсер посередині.

Зовнішні праймери F3 і B3 відповідно складаються з областей F3 і B3 цільового гена.

У реакційній системі LAMP концентрація внутрішнього праймера в кілька разів перевищує концентрацію зовнішнього праймера.Внутрішній праймер спочатку поєднується з шаблонним ланцюгом для синтезу комплементарного ланцюга з утворенням подвійного ланцюга ДНК.Згодом зовнішній праймер поєднується з ланцюгом матриці, щоб утворити подвійний ланцюг ДНК.Під дією BstДНК-полімерази вивільняється комплементарний ланцюг, синтезований внутрішнім праймером.Після серії реакцій комплементарний ланцюг нарешті утворює єдиний ланцюг ДНК зі структурою гантелі.

Сам один ланцюг ДНК зі структурою гантелі використовується як матриця для безперервного формування перехідної структури ДНК зі стовбуровою петлею з відкритим кінцем.Внутрішній і зовнішній праймери спрямовують перехідну структуру стовбурової петлі до безперервного проходження реакцій зміщення та подовження ланцюгів і, нарешті, формування кількох структур стовбурової петлі різної довжини.Суміш ДНК.

Переваги та недоліки петлевого ізотермічного посилення

Переваги LAMP:

(1) Висока ефективність ампліфікації, яка може ефективно ампліфікувати 1-10 копій цільового гена протягом 1 години, а ефективність ампліфікації в 10-100 разів перевищує ефективність звичайної ПЛР.

(2) Час реакції короткий, специфічність сильна, і не потрібне спеціальне обладнання.

Недоліки LAMP:

(1) Вимоги до праймерів особливо високі.

(2) Ампліфікований продукт не можна використовувати для клонування та секвенування, а лише для оцінки.

(3) Завдяки високій чутливості легко утворювати аерозолі, що спричиняє помилкові позитивні результати та впливає на результати тесту.

Sпосилення зміщення транда

Ампліфікація зі зміщенням ланцюга (SDA) — це метод ізотермічної ампліфікації ДНК in vitro, заснований на ферментативній реакції, вперше запропонований американським вченим Вокером у 1992 році.

Основна система SDA включає ендонуклеазу рестрикції, ДНК-полімеразу з активністю заміщення ланцюга, дві пари праймерів, dNTP, іони кальцію та магнію та буферні системи.

Принцип ампліфікації заміщення ланцюга заснований на хімічно модифікованій послідовності розпізнавання ендонуклеази рестрикції на обох кінцях цільової ДНК.Ендонуклеаза відкриває розрив у ланцюзі ДНК у місці його розпізнавання, а ДНК-полімераза розширює розрив 3′-кінець і замінює наступний ланцюг ДНК.

Замінені одиничні ланцюги ДНК можна комбінувати з праймерами та подовжувати в подвійні ланцюги за допомогою ДНК-полімерази.Цей процес безперервно повторюється, щоб цільова послідовність ефективно посилювалася.

Переваги та недоліки технології ампліфікації зміщення пасма

Переваги SDA:

Ефективність ампліфікації висока, час реакції короткий, специфічність сильна, і не потрібне спеціальне обладнання.

Недоліки ПДР:

Продукти не є однорідними, і деякі одноланцюгові та дволанцюгові продукти завжди виробляються в циклі SDA, і хвости неминуче виникнуть, якщо їх виявити за допомогою електрофорезу.

Rпідсилення довжини кола

Ампліфікація рухомого кола (RCA) запропонована на основі методу копіювання ДНК з патогенних організмів шляхом обертання кола.Це стосується використання одноланцюгової кільцевої ДНК як матриці при постійній температурі та спеціальної ДНК-полімерази (наприклад, Phi29) ) Під дією циклічного синтезу ДНК для досягнення ампліфікації цільового гена.

RCA можна розділити на лінійне посилення та експоненціальне посилення.ККД лінійних RCA може досягати 10⁵разів, а ефективність експоненціального RCA може досягати 10⁹разів.

Просте розрізнення, як показано на малюнку нижче, лінійна ампліфікація a використовує лише 1 праймер, експоненціальна ампліфікація b має 2 праймери.

Лінійний RCA також називають однопраймерним RCA.Праймер зв'язується з кільцевою ДНК і подовжується під дією ДНК-полімерази.Продукт являє собою лінійну одну нитку з великою кількістю повторюваних послідовностей, довжина яких у тисячі разів перевищує одну петлю.

Оскільки виріб лінійного RCA завжди підключається до початкового праймера, легка фіксація сигналу є головною перевагою.

Експоненціальна RCA, також відома як гіперрозгалужена ампліфікація HRCA (гіперрозгалужена RCA), в експоненціальній RCA один праймер підсилює продукт RCA, другий праймер гібридизується з продуктом RCA та подовжується, а заміна вже зв’язана з продуктом RCA. Нижчі праймери подовжують ланцюг і повторюють подовження та заміну для отримання дендритного продукту ампліфікації RCA.

Переваги та недоліки ампліфікації нуклеїнової кислоти з рухомим колом

Переваги RCA:

Висока чутливість, хороша специфічність і легкість в експлуатації.

Недоліки RCA:

Фонові проблеми під час виявлення сигналу.Під час реакції RCA нециркулюючий зонд замка та матрична ДНК або РНК незв’язаного зонда можуть генерувати деякі фонові сигнали. 

Nампліфікація на основі послідовності уклеїнової кислоти

Ампліфікація на основі послідовності нуклеїнових кислот (NASBA) — це нова технологія, розроблена на основі ПЛР.Це безперервна та ізотермічна ампліфікація нуклеїнової кислоти, керована парою праймерів із послідовністю промотора Т7.Технологія може ампліфікувати матричну РНК приблизно в 109 разів приблизно за 2 години, що в 1000 разів перевищує звичайний метод ПЛР і не вимагає спеціального обладнання.

Ця технологія була використана для швидкої діагностики захворювань, як тільки вона з’явилася, і зараз багато компаній використовують цей метод у наборах для виявлення РНК.

Хоча для ампліфікації РНК також можна використовувати технологію ПЛР зі зворотною транскрипцією, NASBA має свої переваги: ​​її можна проводити за відносно постійних температурних умов, вона більш стабільна та точна, ніж традиційна технологія ПЛР.

Реакція відбувається при 41 градусі за Цельсієм і вимагає зворотної транскриптази AMV (вірус мієлобластозу птахів), РНКази H, РНК-полімерази T7 і пари праймерів.

Процес в основному включає:

Прямий праймер містить комплементарну послідовність промотору Т7.Під час реакції прямий праймер зв’язується з ланцюгом РНК і каталізується ферментом AMV з утворенням подвійного ланцюга ДНК-РНК.

РНКаза H розщеплює РНК у гібридній дволанцюговій ДНК і зберігає одноланцюгову ДНК.

Під дією зворотного праймера і ферменту AMV утворюється подвійний ланцюг ДНК, що містить послідовність промотора Т7.

Під дією РНК-полімерази Т7 завершується процес транскрипції і утворюється велика кількість цільової РНК.

Переваги NASBA:

(1) Його праймер має послідовність промотора T7, але чужорідна дволанцюгова ДНК не має послідовності промотора T7 і не може бути ампліфікована, тому ця технологія має високу специфічність і чутливість.

(2) NASBA безпосередньо включає процес зворотної транскрипції в реакцію ампліфікації, скорочуючи час реакції.

Недоліки NASBA:

(1) Компоненти реакції складніші.

(2) Для підвищення вартості реакції потрібні три види ферментів.