ПЛР у реальному часі, також відома як кількісна ПЛР або кПЦР, — це метод моніторингу та аналізу продуктів ампліфікації ПЛР у реальному часі.
Оскільки кількісна ПЛР має такі переваги, як проста операція, швидка і зручна, висока чутливість, хороша повторюваність і низький рівень забруднення, вона широко використовується в медичних тестах, оцінці ефективності ліків, дослідженнях експресії генів, трансгенних дослідженнях, виявленні генів, виявленні патогенів, виявленні тварин і рослин., тестування харчових продуктів та інші сфери.
Таким чином, незалежно від того, чи займаєтеся ви фундаментальними дослідженнями в галузі наук про життя, чи працівники фармацевтичних компаній, тваринницьких компаній, харчових компаній або навіть співробітники інспекції в’їзду-виїзду та карантинних бюро, відділів моніторингу навколишнього середовища, лікарень та інших підрозділів, ви будете більшою чи меншою мірою піддані Або вам потрібно знати знання щодо опанування кількісної ПЛР.

Принцип ПЛР у реальному часі

ПЛР у реальному часі - це метод, при якому флуоресцентні речовини додаються до реакційної системи ПЛР, і інтенсивність сигналу флуоресценції в процесі реакції ПЛР контролюється в режимі реального часу приладом для кількісної ПЛР, і, нарешті, експериментальні дані аналізуються та обробляються.

【Крива посилення】– крива, що описує динамічний процес ПЛР.Крива ампліфікації ПЛР насправді не є стандартною експоненціальною кривою, а сигмоподібною.

[Платформна фаза кривої ампліфікації]Зі збільшенням кількості циклів ПЛР, інактивацією ДНК-полімерази, виснаженням dNTP і праймерів та інгібуванням реакції синтезу побічним продуктом реакції пірофосфатом тощо, ПЛР не завжди розширюється експоненціально., і зрештою вийде на плато.

[Область експоненціального зростання кривої ампліфікації]Хоча фаза плато сильно змінюється, у певній області експоненціального зростання кривої ампліфікації повторюваність дуже добра, що дуже важливо для кількісного аналізу ПЛР.

[Порогове значення та значення Ct]Ми встановлюємо граничне значення виявлення флуоресценції у відповідній позиції в області експоненціального зростання кривої ампліфікації, а саме порогове значення (Threshold).Точка перетину порогового значення та кривої посилення є значенням Ct, тобто значення Ct відноситься до кількості циклів (порогового циклу), коли досягається порогове значення.

На графіку нижче чітко показано співвідношення між пороговою лінією та кривою ампліфікації, порогом і значенням Ct.

【Як кількісно визначити?】

Математичною теорією доведено, що значення Ct має зворотну лінійну залежність від логарифма кількості вихідних шаблонів.ПЛР у реальному часі відстежує продукти ампліфікації ПЛР у режимі реального часу та визначає їх кількість під час експоненціальної фази ампліфікації.

Для кожного циклу ПЛР ДНК експоненціально зростала в 2 рази і незабаром досягла плато.

Припускаючи, що кількість вихідної ДНК дорівнює А₀ , після n циклів теоретичну кількість продукту ДНК можна виразити як:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Тоді, чим більше початкова кількість ДНК A 0, тим швидше кількість ампліфікованого продукту досягне значення виявлення An, а кількість циклів при досягненні An є значенням Ct.Тобто, чим більше початкова кількість ДНК A 0, тим раніше досягається пік кривої ампліфікації, і відповідно меншою є необхідна кількість циклів n.

Ми проводимо градієнтне розведення стандарту відомої концентрації та використовуємо його як матрицю для ПЛР у реальному часі, і серія кривих ампліфікації буде отримана через рівні проміжки часу в порядку початкової кількості ДНК від більшої до меншої.Відповідно до лінійної залежності між значенням Ct і логарифмом кількості початкових шаблонів, a[стандартна крива] може бути створена.

Підставляючи значення Ct зразка з невідомою концентрацією в стандартну криву, можна отримати початкову кількість шаблону зразка з невідомою концентрацією, що є кількісним принципом ПЛР у реальному часі.

Метод виявлення ПЛР у реальному часі

ПЛР у реальному часі виявляє продукти ампліфікації ПЛР шляхом визначення інтенсивності флуоресценції в реакційній системі.

Принцип методу впровадження флуоресцентного барвника】

Флуоресцентні барвники, такі як TB Green ® , можуть неспецифічно зв’язуватися з дволанцюговою ДНК у системах ПЛР і флуоресцувати після зв’язування.

Інтенсивність флуоресценції в реакційній системі експоненціально зростала зі збільшенням циклів ПЛР.Визначаючи інтенсивність флуоресценції, кількість ампліфікації ДНК в реакційній системі можна контролювати в режимі реального часу, а потім кількість вихідної матриці в зразку можна оцінити в зворотному порядку.

【Принцип методу флуоресцентного зонда】

флуоресцентний зондявляє собою послідовність нуклеїнової кислоти з флуоресцентною групою на 5'-кінці та групою гасіння на 3'-кінці, яка може специфічно зв'язуватися з матрицею.Коли зонд неушкоджений, флуоресценція, випромінювана флуорофором, гаситься групою гасіння і не може флуоресцувати.Коли зонд розкладається, флуоресцентна речовина дисоціює і випромінює флуоресценцію.

До реакційного розчину ПЛР додають флуоресцентний зонд.Під час процесу відпалу флуоресцентний зонд зв’яжеться з певним положенням шаблону.Під час процесу подовження 5′→3′ екзонуклеазна активність ферменту ПЛР може розкласти флуоресцентний зонд, гібридизований з матрицею, і флуоресцентна речовина дисоціює, випромінюючи флуоресценцію.За допомогою визначення інтенсивності флуоресценції зонда в реакційній системі можна досягти мети моніторингу кількості ампліфікованого продукту ПЛР.

【Вибір методу виявлення флуоресценції】

Якщо він використовується для розрізнення послідовностей з високою гомологією та проведення мультиплексного виявлення ПЛР, такого як аналіз типування SNP, метод флуоресцентного зонда є незамінним.
Для інших експериментів ПЛР у реальному часі можна використовувати простий, легкий і недорогий метод флуоресцентної химери.

зонди Сильна специфічність, здатні до мультиплексної ПЛР

Недолік

Високі вимоги до специфічності ампліфікації;

мультиплексна ПЛР не може бути проведена Необхідність розробки спеціальних зондів, висока вартість;

іноді конструкція зонда складна

Супутні товари: