Значення Ct є найважливішою формою представлення результату флуоресцентної кількісної ПЛР.Він використовується для обчислення відмінностей експресії генів або кількості копій гена.Отже, яке значення Ct кількісного визначення флуоресценції вважається прийнятним?Як забезпечити ефективний діапазон значення Ct?

Що таке значення Ct?
Під час процесу ПЛР-ампліфікації відповідна кількість циклів ампліфікації (поріг циклу), коли сигнал флуоресценції ампліфікованого продукту досягає встановленого порогу флуоресценції.C означає цикл, а T означає поріг.Простіше кажучи, значення Ct — це кількість циклів, що відповідають моменту, коли початкова ампліфікація шаблону досягає певної кількості продукту в кПЦР.Так звана «певна кількість продукту» буде пояснена далі.

Що означає значення Ct?

1. Зв’язок між експоненціальним посиленням, величиною шаблону та значенням Ct
В ідеалі гени в КПЦР накопичуються шляхом експоненціальної ампліфікації після певної кількості циклів.Відношення між кількістю циклів ампліфікації та кількістю продуктів таке: кількість ампліфікованого продукту = початкова кількість шаблону × (1+En) кількість циклів.Однак реакція КПЦР не завжди є ідеальною.Коли кількість ампліфікованого продукту досягає «певної кількості продукту», кількість циклів у цей час є значенням Ct, і воно знаходиться в експоненціальному періоді ампліфікації.Зв’язок між значенням Ct і кількістю початкового шаблону: існує лінійна залежність між значенням Ct шаблону та логарифмом початкового номера копії шаблону.Чим вище початкова концентрація матриці, тим менше значення Ct;чим нижче початкова концентрація матриці, тим більше значення Ct.

2. Крива ампліфікації, поріг флуоресценції та певна кількість продукту ПЛР
Кількість продукту ампліфікації qPCR безпосередньо представлена ​​у вигляді флуоресцентного сигналу, тобто кривої ампліфікації.На ранній стадії ПЛР ампліфікація відбувається в ідеальних умовах, кількість циклів невелика, накопичення продукту невелике, а рівень флуоресценції не можна чітко відрізнити від фону флуоресценції.Після цього флуоресценція зростає і переходить в експоненціальну фазу.Кількість продукту ПЛР можна виявити в певний момент, коли реакція ПЛР знаходиться в експоненціальній фазі, яку можна використовувати як «певну кількість продукту», і з цього можна зробити висновок про початковий вміст матриці.Таким чином, інтенсивність сигналу флуоресценції, що відповідає певній кількості продукту, є порогом флуоресценції.

На пізній стадії ПЛР крива ампліфікації більше не показує експоненціальну ампліфікацію та переходить у лінійну фазу та фазу плато.

3. Відтворюваність значень Ct
Коли цикл ПЛР досягає номера циклу значення Ct, він щойно увійшов у справжній експоненціальний період ампліфікації.У цей час невелика помилка не посилюється, тому відтворюваність значення Ct чудова, тобто той самий шаблон посилюється в різний час або в різних пробірках одночасно.Підсилення, отримане значення Ct є постійним.

1. Ефективність підсилення En
Ефективність ампліфікації методом ПЛР означає ефективність, з якою полімераза перетворює ген, що підлягає ампліфікації, на амплікон.Ефективність ампліфікації при перетворенні однієї молекули ДНК на дві молекули ДНК становить 100%.Ефективність підсилення зазвичай виражається як En.Для того, щоб полегшити аналіз наступних статей, коротко представлено фактори, які впливають на ефективність підсилення.

2. Діапазон значень Ct
Значення Ct коливаються від 15-35.Якщо значення Ct менше 15, вважається, що ампліфікація знаходиться в межах базового періоду і поріг флуоресценції не досягнутий.В ідеалі існує лінійна залежність між значенням Ct і логарифмом початкового номера копії шаблону, тобто стандартної кривої.Через стандартну криву, коли ефективність ампліфікації становить 100%, розраховане значення Ct для кількісного визначення кількості однієї копії гена становить близько 35. Якщо воно більше 35, початкова кількість копій шаблону теоретично менша за 1, що можна вважати безглуздим.

Для різних діапазонів Ct гена, через різницю в кількості копій гена та ефективності ампліфікації в початковій кількості матриці, необхідно зробити стандартну криву для гена та розрахувати лінійний діапазон виявлення гена.

3. Фактори, що впливають на величину Ct
Із співвідношення між кількістю циклів ампліфікації та кількістю продукту: кількість ампліфікованого продукту = кількість початкового шаблону × (1+En) номер циклу, можна побачити, що за ідеальних умов кількість початкового шаблону та En матиме негативний вплив на значення Ct.Різниця в якості шаблону або ефективності посилення призведе до того, що значення Ct буде занадто великим або занадто малим.

4. Значення Ct занадто велике або занадто мале