Втрата слуху (HL) є найпоширенішим сенсорним захворюванням у людей.У розвинутих країнах близько 80% випадків прелінгвальної приглухуватості у дітей викликані генетичними факторами.Найбільш поширеними є одногенні дефекти (як показано на рис. 1), було встановлено, що 124 генні мутації пов’язані з несиндромальною втратою слуху у людей, решта спричинені факторами навколишнього середовища.Кохлеарний імплантат (електронний пристрій, розміщений у внутрішньому вусі, який забезпечує електричну стимуляцію безпосередньо до слухового нерва) є, безумовно, найефективнішим варіантом для лікування тяжкого HL, тоді як слуховий апарат (зовнішній електронний пристрій, який перетворює та підсилює звукові хвилі) може допомогти пацієнтам із помірним HL.Однак наразі немає ліків для лікування спадкової HL (GHL).В останні роки генна терапія приділяє все більше уваги як багатообіцяючий підхід до лікування дисфункції внутрішнього вуха.

Рис.1.Розподіл варіаційного типу, пов’язаного з глухотою.[1]

Нещодавно вчені з Інституту Солка та Університету Шеффілда опублікували результати дослідження в Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], які показали широкі перспективи застосування генної терапії спадкової глухоти in vivo.Урі Манор, доцент Інституту Солка та директор Центру вдосконаленої біофотоніки Вейта, сказав, що він народився з серйозною втратою слуху і вважає, що відновлення слуху було б чудовим подарунком.Його попередні дослідження показали, що Eps8 є регуляторним білком актину, який має активність зв’язування та блокування актину;у кохлеарних волоскових клітинах білковий комплекс, утворений Eps8 з MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 і GNAI3, в основному існує в більшості. Кінчики довгих стереоцилій, які разом з MYO15A локалізують BAIAP2L2 на кінчиках коротших стереоцилій, необхідні для підтримки пучків волосся.Таким чином, Eps8 може регулювати довжину стереоцилій волоскових клітин, що є важливим для нормальної функції слуху;Видалення або мутація Eps8 призведе до коротких стереоцилій, через що він не зможе належним чином перетворювати звук в електричні сигнали для сприйняття мозком, що, у свою чергу, призводить до глухоти..У той же час співавтор Волтер Маркотті, професор Університету Шеффілда, виявив, що волоскові клітини не можуть нормально розвиватися за відсутності Eps8.У цьому дослідженні Манор і Маркотті об’єдналися, щоб дослідити, чи може додавання Eps8 до стереоциліарних клітин відновити їхню функцію і, у свою чергу, покращити слух у мишей.Дослідницька група використовувала вектор Anc80L65 аденоасоційованого вірусу (AAV) для доставки кодуючої послідовності, що містить EPS8 дикого типу, у вушну раковину новонароджених мишей Eps8-/- P1-P2 за допомогою ін’єкції мембрани круглого вікна;у мишачих кохлеарних волоскових клітинах Функція стереоцилій була відновлена ​​до того, як вони дозріли;і ефект відновлення характеризувався технологією візуалізації та вимірюванням стереоцилій.Результати показали, що Eps8 збільшив довжину стереоцилій і відновив функцію волоскових клітин у низькочастотних клітинах.Вони також виявили, що з часом клітини, схоже, втрачають здатність бути врятованими за допомогою цієї генної терапії.Мається на увазі те, що це лікування може знадобитися внутрішньоутробно, оскільки волоскові клітини Eps8-/- могли дозріти або накопичити пошкодження, які неможливо відновити після народження мишей.«Eps8 — це білок із багатьма різними функціями, і нам ще багато чого потрібно дослідити», — сказав Менор.Майбутні дослідження включатимуть дослідження ефекту генної терапії Eps8 у відновленні слуху на різних стадіях розвитку та чи можливо продовжити можливості лікування.За збігом обставин у листопаді 2020 року професор Карен Авраам з Тель-Авівського університету в Ізраїлі опублікував свої результати в журналі EMBO Molecular Medicine [3], використовуючи інноваційну технологію генної терапії для створення нешкідливого синтетичного аденоасоційованого вірусу AAV9-PHP.B. Генний дефект у волоскових клітинах мишей Syne4-/- був виправлений шляхом ін’єкції вірусу, що несе кодуючу послідовність Syne4, у внутрішнє вухо мишей, що дозволило йому проникнути у волоскові клітини та вивільнити переносимий генетичний матеріал, що дозволило їм дозріти та нормально функціонувати (як на рис. 2).

Рис.2.Схематичне зображення анатомії внутрішнього вуха з акцентом на кортієвому органі та клітинній функції nesprin-4.

Можна побачити, що використання генної терапії для досягнення мети лікування спадкових захворювань на генному рівні шляхом введення, видалення або корекції будь-яких мутованих генів для лікування (тобто контролю генетичних змін захворювання) має високий клінічний ефект.перспективи застосування.Сучасні методи генної терапії генетично дефіцитної глухоти можна розділити на такі категорії:

заміна гена

Заміна гена є, мабуть, найбільш «простою» формою генної терапії, яка базується на ідентифікації та заміні дефектного гена нормальною або дикого типу копією гена.Перше успішне дослідження генної терапії внутрішнього вуха для втрати слуху, спричиненої делецією гена везикулярного транспортера глутамату 3 (VGLUT3);AAV1-опосередкована доставка екзогенної надмірної експресії VGLUT3 у волоскових клітинах внутрішнього вуха (IHC) може призвести до стійкого відновлення слуху, часткового відновлення синаптичної морфології стрічки та судомних реакцій [4].Однак у прикладах, включаючи дві заміни генів, доставлених AAV, описаних у вступі вище, важливо зазначити, що мишачі моделі, які використовуються для певних типів спадкових розладів втрати слуху при видаленні генів, тимчасово відрізняються від людських, а у мишей P1 внутрішнє вухо перебуває на зрілій стадії розвитку.Навпаки, люди народжуються зі зрілим внутрішнім вухом.Ця різниця запобігає можливому застосуванню результатів мишей для лікування спадкових розладів глухоти у людини, якщо генна терапія не проводиться на зрілі вуха миші.

Редагування генів: CRISPR/Cas9

Порівняно із «заміною генів», розвиток технології редагування генів приніс початок лікуванню генетичних захворювань від кореня.Важливо, що метод редагування генів компенсує недоліки традиційних методів генної терапії з надмірною експресією, які не підходять для домінантних спадкових захворювань глухоти, а також проблему, пов’язану з тим, що метод надмірної експресії не діє довго.Після того, як китайські дослідники спеціально нокаутували мутантний алель Myo6C442Y у мишей Myo6WT/C442Y за допомогою системи редагування генів AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, і протягом 5 місяців після нокауту миші Слухова функція моделі була відновлена;при цьому також спостерігалося покращення виживаності волоскових клітин у внутрішньому вусі, форма війок стала правильною, електрофізіологічні показники були скориговані [5].Це перше у світі дослідження, яке використовує технологію CRISPR/Cas9 для лікування спадкової глухоти, викликаної мутацією гена Myo6, і це важливий прогрес у дослідженні технології редагування генів для лікування спадкової глухоти.Клінічний переклад лікування забезпечує надійну наукову основу.

Методи генної терапії

Щоб генна терапія була успішною, оголені молекули ДНК не можуть ефективно проникати в клітини через їх гідрофільність і негативний заряд фосфатних груп, і для забезпечення цілісності доповнених молекул нуклеїнових кислот необхідно вибрати безпечний і ефективний метод.Доповнена ДНК доставляється до цільової клітини або тканини.AAV широко використовується як засіб доставки для лікування захворювань завдяки його високому інфекційному ефекту, низькій імуногенності та широкому тропізму до різних типів тканин.На даний момент велика кількість дослідницьких робіт визначила тропність різних підтипів AAV відносно різних типів клітин у вушній раковині миші.Використання характеристик доставки AAV у поєднанні з клітинно-специфічними промоторами може досягти клітинно-специфічної експресії, що може зменшити нецільові ефекти.Крім того, як альтернатива традиційним векторам AAV постійно розробляються нові синтетичні вектори AAV, які демонструють чудову здатність трансдукції у внутрішньому вусі, з яких AAV2/Anc80L65 є найбільш широко використовуваним.Невірусні методи доставки можна далі розділити на фізичні методи (мікроін’єкції та електропорація) та хімічні методи (на основі ліпідів, полімерів і наночастинок золота).Обидва підходи використовувалися в лікуванні спадкових розладів глухоти і продемонстрували різні переваги та обмеження.На додаток до транспортного засобу для генної терапії як транспортного засобу, можна застосовувати різні підходи для введення генів in vivo на основі різних типів клітин-мішеней, шляхів введення та терапевтичної ефективності.Складна структура внутрішнього вуха ускладнює доступ до клітин-мішеней, а розповсюдження агентів редагування геному відбувається повільно.Перетинчастий лабіринт розташований у кістковому лабіринті скроневої кістки і включає кохлеарну протоку, напівкруглу протоку, матку та балон.Його відносна ізоляція, мінімальна лімфатична циркуляція та відділення від крові кровоносним лабіринтом обмежують ефективну системну доставку терапевтичних засобів лише новонародженим мишам.Для отримання вірусних титрів, придатних для генної терапії, необхідна пряма місцева ін’єкція вірусних векторів у внутрішнє вухо.Встановлені шляхи ін’єкції включають [6]: (1) круглу віконну мембрану (RWM), (2) трахеостомію, (3) ендолімфатичну або перилімфатичну кохлеостомію, (4) круглу віконну мембрану плюс трубчасту фенестрацію (CF) (як на рис. 3).

Рис.3.Генна терапія внутрішнього вуха.

Незважаючи на те, що в генній терапії було досягнуто багато успіхів, які базуються на цілях клінічної трансляції, необхідно ще багато роботи, перш ніж генна терапія стане варіантом лікування першої лінії для пацієнтів із генетичними захворюваннями, особливо в розробці безпечних і ефективних векторів і методів доставки.Але ми віримо, що в найближчому майбутньому ці види лікування стануть основним продуктом персоналізованої терапії та матимуть надзвичайно позитивний вплив на життя людей із генетичними розладами та їхніх родин.

Foregene також випустила високопродуктивний набір для скринінгу цільових генів, який є швидким і може виконувати реакції зворотної транскрипції та кПЦР без екстракції РНК.

Посилання на продукти

Набір Cell Direct RT-qPCR—Taqman/SYBR GREEN I

Для отримання додаткової інформації про продукт, будь ласка, зв'яжіться з:

overseas@foregene.com