Технологія молекулярної діагностики використовує методи молекулярної біології для виявлення експресії та структури генетичного матеріалу людського тіла та різних патогенів, щоб досягти мети прогнозування та діагностики захворювань.

В останні роки з модернізацією та ітерацією технології молекулярної діагностики клінічне застосування молекулярної діагностики стає все більш широким і поглибленим, і ринок молекулярної діагностики вступив у період швидкого розвитку.

Автор узагальнює загальні технології молекулярної діагностики на ринку та розділений на три частини: перша частина представляє технологію ПЛР, друга частина представляє технологію ізотермічної ампліфікації нуклеїнових кислот, а друга частина представляє технологію секвенування.

01

Частина I: Технологія ПЛР

ПЛР-технологія

ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) є однією з технологій ампліфікації ДНК in vitro, історія якої налічує понад 30 років.

Технологія ПЛР була започаткована в 1983 році Кері Муллісом із Сетуса, США.Малліс подав заявку на отримання патенту на ПЛР у 1985 році та опублікував першу наукову статтю про ПЛР у тому ж році.Мулліс отримав Нобелівську премію з хімії в 1993 році.

Основні принципи ПЛР

ПЛР може ампліфікувати цільові фрагменти ДНК більш ніж в мільйон разів.Принцип полягає в тому, що під час каталізу ДНК-полімерази батьківський ланцюг ДНК використовується як матриця, а специфічний праймер використовується як початкова точка для подовження.Він відтворюється in vitro за допомогою таких етапів, як денатурація, відпал і розширення.Процес дочірньої ланцюга ДНК, комплементарний матричній ДНК батьківського ланцюга.

Стандартний процес ПЛР ділиться на три етапи:

1. Денатурація: використовуйте високу температуру для розділення подвійних ланцюгів ДНК.Водневі зв'язки між подвійними ланцюгами ДНК розриваються при високих температурах (93-98°С).

2. Відпал: після відокремлення дволанцюгової ДНК температуру знижують, щоб праймер міг зв’язатися з одноланцюговою ДНК.

3. Подовження: ДНК-полімераза починає синтезувати комплементарні ланцюги вздовж ланцюгів ДНК із зв’язаних праймерів, коли температура знижується.Коли подовження завершується, цикл завершується, і кількість фрагментів ДНК подвоюється.

Повторюючи ці три кроки 25-35 разів, кількість фрагментів ДНК зростатиме експоненціально.

Винахідливість ПЛР полягає в тому, що різні праймери можуть бути розроблені для різних цільових генів, так що фрагменти цільового гена можуть бути ампліфіковані за короткий проміжок часу.

На даний момент ПЛР можна розділити на три категорії, а саме звичайну ПЛР, флуоресцентну кількісну ПЛР і цифрову ПЛР.

Звичайна ПЛР першого покоління

Використовуйте звичайний інструмент ПЛР-ампліфікації для ампліфікації цільового гена, а потім використовуйте електрофорез у агарозному гелі для виявлення продукту, можна провести лише якісний аналіз.

Основні недоліки ПЛР першого покоління:

- Схильність до неспецифічної ампліфікації та хибнопозитивних результатів.

- Виявлення займає багато часу, і операція є громіздкою.

– Можна проводити тільки якісне тестування.

Флуоресцентна кількісна ПЛР другого покоління

Флуоресцентна кількісна ПЛР (ПЛР у реальному часі), також відома як qPCR, використовується для моніторингу накопичення ампліфікованих продуктів через накопичення флуоресцентних сигналів шляхом додавання флуоресцентних зондів, які можуть вказувати на перебіг реакційної системи, і для оцінки результатів за допомогою кривої флуоресценції, і його можна кількісно визначити за допомогою значення Cq і стандартної кривої.

Оскільки технологія qPCR виконується в закритій системі, ймовірність зараження зменшується, а сигнал флуоресценції можна контролювати для кількісного виявлення, тому вона найбільш широко використовується в клінічній практиці та стала домінуючою технологією в ПЛР.

Флуоресцентні речовини, які використовуються у флуоресцентній кількісній ПЛР у реальному часі, можна розділити на: флуоресцентні зонди TaqMan, молекулярні маяки та флуоресцентні барвники.

1) Флуоресцентний зонд TaqMan:

Під час ПЛР-ампліфікації додається специфічний флуоресцентний зонд, додаючи пару праймерів.Зонд є олігонуклеотидом, а два кінці відповідно помічені репортерною флуоресцентною групою та гасильною флуоресцентною групою.

Коли зонд неушкоджений, флуоресцентний сигнал, випромінюваний репортерною групою, поглинається групою гасіння;під час ПЛР-ампліфікації екзонуклеазна активність 5′-3′ ферменту Taq розщеплює та розщеплює зонд, роблячи репортерну флуоресцентну групу та гасник. Флуоресцентна група відокремлюється, щоб система моніторингу флуоресценції могла приймати сигнал флуоресценції, тобто щоразу, коли ланцюг ДНК ампліфікується, утворюється флуоресцентна молекула, а накопичення сигналу флуоресценції відбувається повністю синхронізується з утворенням продукту ПЛР.

2) флуоресцентні барвники SYBR:

У реакційну систему ПЛР додається надлишок флуоресцентного барвника SYBR.Після того, як флуоресцентний барвник SYBR неспецифічно включений у подвійний ланцюг ДНК, він випромінює флуоресцентний сигнал.Молекула барвника SYBR, яка не включена в ланцюг, не буде випромінювати флуоресцентний сигнал, тим самим забезпечуючи флуоресцентний сигнал. Збільшення продуктів ПЛР повністю синхронізовано зі збільшенням продуктів ПЛР.SYBR зв’язується лише з дволанцюговою ДНК, тому криву плавлення можна використовувати для визначення специфічності реакції ПЛР.

3) Молекулярні маяки

Це подвійно мічений олігонуклеотидний зонд зі стовбуровою петлею, який утворює структуру шпильки приблизно з 8 основ на 5 і 3 кінцях.Послідовності нуклеїнової кислоти на обох кінцях комплементарно з’єднуються, що призводить до того, що флуоресцентна група та група гасіння є тісними.Закрийте, він не вироблятиме флуоресценції.

Після генерації продукту ПЛР під час процесу відпалу середня частина молекулярного маяка з’єднується з певною послідовністю ДНК, а флуоресцентний ген відокремлюється від гена гасника для отримання флуоресценції.

Основні недоліки ПЛР другого покоління:

Чутливість все ще недостатня, а виявлення низькокопійних зразків є неточним.

Існує вплив фонового значення, і результат чутливий до перешкод.

Цифрова ПЛР третього покоління

Цифрова ПЛР (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) обчислює кількість копій цільової послідовності за допомогою визначення кінцевої точки та може виконувати точне абсолютне кількісне виявлення без використання внутрішнього контролю та стандартних кривих.

Цифрова ПЛР використовує виявлення кінцевої точки і не залежить від значення Ct (порогове значення циклу), тому на реакцію цифрової ПЛР менше впливає ефективність ампліфікації, а толерантність до інгібіторів реакції ПЛР покращується з високою точністю та відтворюваністю.

Завдяки характеристикам високої чутливості та високої точності інгібітори ПЛР-реакцій нелегко впливають на нього, і він може досягти справжнього абсолютного кількісного визначення без використання стандартних продуктів, що стало гарячою точкою для досліджень і застосування.

Відповідно до різних форм реакційного блоку, його можна розділити на три типи: мікрофлюїдні, чіпові та краплинні системи.