В експериментах qPCR дизайн праймера також є дуже важливою ланкою.Чи придатні праймери чи ні, тісно пов’язано з тим, чи ефективність ампліфікації досягає стандарту, чи є ампліфіковані продукти специфічними та чи доступні експериментальні результати.
Отже, як покращити специфічність праймера кПЛР?Висока ефективність підсилення?
Сьогодні ми разом розробимо праймери кПЛР, і нехай розробка праймерів кПЛР стане ефективним навиком вивчення знань в експериментах.
При розробці праймерів qPCR зазвичай звертайте увагу на такі моменти: праймери мають бути розроблені якомога ближче до інтронів, довжина продукту має становити 100-300 bp, значення Tm має бути якомога ближче до 60°C, а праймери вище та нижче за течією мають бути якомога ближче, а кінець праймера має бути G або C тощо. Зачекайте.
1. Дизайн праймерів, що охоплюють інтрони
При розробці праймерів кПЛР вибір праймерів, розроблених через інтрони, може запобігти ампліфікації матриці гДНК, а всі продукти отримують в результаті ампліфікації кДНК, таким чином усуваючи вплив забруднення гДНК.
2. Довжина грунтовки
Довжина праймера, як правило, становить 18-30 нт, а довжину продукту ампліфікації слід контролювати в межах 100-300 bp, наскільки це можливо.
Якщо праймер занадто короткий, це призведе до неспецифічної ампліфікації, а якщо він занадто довгий, він легко утворить вторинну структуру (наприклад, структуру шпильки).Якщо продукт ампліфікації занадто довгий, він не підходить для реакції полімерази, що вплине на ефективність ПЛР-ампліфікації.
3. Вміст GC і значення Tm
Вміст GC у праймерах слід контролювати між 40% і 60%.Якщо він занадто високий або занадто низький, це не сприяє ініціації реакції.Вміст GC прямого і зворотного праймерів повинен бути близьким до однакового, щоб отримати однакове значення Tm і температуру відпалу.
Значення Tm має бути в діапазоні 55-65°C, наскільки це можливо, як правило, близько 60°C, а значення Tm переднього та нижнього потоків має бути якомога ближче, бажано не більше 4°C.
4. Уникайте вибору A на 3' кінці праймера
Коли 3'-кінець праймера не збігається, існують великі відмінності в ефективності синтезу різних основ.Коли останньою основою є A, вона також може ініціювати ланцюговий синтез навіть у разі невідповідності, а коли останньою основою є T, коли , ефективність індукції невідповідності значно знижується.Тому намагайтеся уникати вибору A на 3' кінці праймера, а краще вибрати T.
Якщо це праймер зонда, 5'-кінець зонда не може бути G, тому що навіть коли одна основа G підключена до флуоресцентної репортерної групи FAM, G також може гасити флуоресцентний сигнал, випромінюваний групою FAM, що призводить до хибнонегативних результатів.З'являтися.
5. Базовий розподіл
Розподіл чотирьох основ у праймері переважно є випадковим, уникаючи більше ніж 3 послідовних G або C на 3'-кінці та більше 3 послідовнихG або C легко створити пару в багатій на GC області послідовності.
6. Ділянка грунтовки повинна уникати складних вторинних структур.
Вторинна структура, утворена одним ланцюгом продукту ампліфікації, впливатиме на плавний хід ПЛР.Прогнозуючи заздалегідь, чи є вторинна структура в цільовій послідовності, намагайтеся уникати цієї області в дизайні праймерів.
7. Самі праймери та між праймерами повинні намагатися уникати послідовних комплементарних основ.
Між самим праймером і праймером не може бути комплементарності послідовних 4 основ.Праймер сам по собі не повинен мати комплементарну послідовність, інакше він сам згорнеться, утворюючи структуру шпильки, що вплине на комбінацію відпалу праймера та шаблону.
Комплементарні послідовності не можуть існувати між висхідними та нижніми праймерами.Комплементарність між праймерами призведе до утворення димерів праймерів, що знизить ефективність ПЛР і навіть вплине на кількісну точність.Якщо структури праймер-димер і шпилька неминучі, значення △G не повинно бути занадто високим (має бути менше 4,5 ккал/моль).
8. Праймери посилюють цільовий специфічний продукт.
Кінцевою метою виявлення КПЦР є визначення кількості цільового гена.Якщо відбувається неспецифічна ампліфікація, кількісне визначення буде неточним.Таким чином, після того, як праймери розроблені, їх потрібно протестувати за допомогою BLAST, а специфічність продуктів порівняти в базі даних послідовностей.
Далі ми беремо людський ген GAS6 (специфічна зупинка росту 6) як приклад для розробки праймерів qPCR.
01 запит ген
Homo GAS6через NCBI.Тут ми повинні звернути увагу на порівняння назви гена та виду, щоб переконатися, що вони узгоджуються.
02 Знайдіть послідовність гена
(1) Якщо цільовою послідовністю є геномна ДНК, виберіть першу, яка є послідовністю геномної ДНК гена.
(2) Якщо цільовою послідовністю є мРНК, виберіть другу.Після введення натисніть «CDS» у таблиці нижче.Послідовність коричневого фону є кодуючою послідовністю гена.
03 Праймери дизайну
Увійдіть в інтерфейс Primer-BLAST
Введіть порядковий номер гена або послідовність у форматі Fasta у верхньому лівому куті та заповніть відповідні параметри.

Натисніть «Отримати праймери», і з’явиться спливаюче вікно NCBI, яке повідомить вам, що такий вибір параметра буде розширено для інших варіантів зварювання.Ми можемо перевірити різні варіанти зрощування та надіслати їх, щоб отримати відповідну пару праймерів (як показано на малюнку нижче).Цей процес може тривати десятки секунд.
Температури відпалу цих пар праймерів становлять близько 60°C.Відповідно до мети експерименту, виберіть для експерименту праймери з помірною довжиною, хорошою специфічністю та меншою самокомплементацією праймерів, і рівень успіху буде досить високим!
04 Перевірка специфічності праймера
Насправді, крім розробки праймерів, Primer-Blast також може оцінити праймери, які ми розробили самі.Поверніться до сторінки дизайну праймерів, введіть розроблені нами початкові та нижчі праймери, і інші параметри не будуть налаштовані.Після надсилання ви можете побачити, чи існує пара праймерів також на інших генах.Якщо всі вони відображаються на гені, який ми хочемо ампліфікувати, це означає, що специфічність цієї пари праймерів велика!(Наприклад, це єдиний результат запиту праймера!)

05 Оцінка якості грунтовки
Який тип праймера є «ідеальним» праймером, який поєднує «ефективність посилення на рівні стандарту», ​​«посилені характеристики продукту» та «надійні експериментальні результати»?
Ефективність посилення

крива плавлення
Ефективність ампліфікації праймерів досягає 90%-110%, що означає, що ефективність ампліфікації хороша, а крива плавлення має один пік і зазвичай Tm>80°C, що означає, що специфічність ампліфікації хороша.
 
Супутні товари:
ПЛР у реальному часі Easy–SYBR GREEN I
ПЛР у реальному часі Easy-Taqman