Відмінною особливістю реакції ПЛР є її велика здатність до ампліфікації та надзвичайно висока чутливість.Щоб покращити продуктивність ПЛР та ефективність виявлення, ми прагнемо покращити здатність ПЛР-ампліфікації та чутливість виявлення, але головний біль полягає в процесі експерименту.Часто виникають помилкові позитивні результати, і дуже невелика кількість перехресного забруднення зразка або забруднення продукту ПЛР може спричинити помилкові позитивні результати в експерименті.
П'ять типів зараження продукту ПЛР
Існує багато причин зараження ПЛР, які можна умовно розділити на такі категорії:
Забруднення зразка в основному спричинене забрудненням контейнера для збору зразка, або коли зразок поміщено, він витікає з контейнера через нещільне ущільнення, або зразок прилипає до зовнішньої частини контейнера, що спричиняє перехресне забруднення;Забруднення призводить до зараження між зразками;деякі мікробні зразки, особливо віруси, можуть поширюватися з аерозолями або утворювати аерозолі, що призводить до взаємного зараження.
Основна причина полягає в тому, що під час приготування реагентів ПЛР пістолет для зразків, контейнер, двічі дистильована вода та інші розчини забруднені матрицею нуклеїнової кислоти ПЛР.
У лабораторіях молекулярної біології та деяких лабораторіях, які використовують клоновані плазміди як позитивний контроль, проблема забруднення клонованими плазмідами також є поширеною.Оскільки вміст плазміди для клонування в одиниці об’єму є досить високим, і в процесі очищення потрібно більше інструментів і реагентів, і плазміда в живих клітинах дуже ймовірно буде забруднена через потужну здатність живих клітин до росту та розмноження.
Забруднення ампліфікованих продуктів є найпоширенішою проблемою забруднення в реакціях ПЛР.Оскільки кількість копій продукту ПЛР є великою (зазвичай 1013 копій/мл), що значно перевищує ліміт кількості копій для виявлення ПЛР, дуже невелика кількість забруднення продукту ПЛР може викликати хибнопозитивні результати.
Аерозольні забруднення є найбільш імовірною формою забруднення продуктів ПЛР, і їх також найлегше не помітити.Він утворюється внаслідок тертя між поверхнею рідини та повітрям.Як правило, аерозольне забруднення може утворюватися, коли кришку відкривають, коли зразок аспірують або навіть коли реакційну пробірку енергійно струшують.Згідно з розрахунками, частинка аерозолю може містити 48 000 копій, тому спричинене нею забруднення є проблемою, яка заслуговує на особливу увагу.
Зокрема, тестові лабораторії часто використовують ту саму пару праймерів для перевірки певного гена.Згодом у лабораторних приміщеннях виникне велика кількість забруднення продукту ПЛР.Як тільки таке забруднення виникає, його важко усунути за короткий час.
Для перших трьох типів забруднення ми можемо використовувати ефективні засоби, щоб уникнути, але забруднення, спричинене продуктами ПЛР, важко запобігти, особливо при будівництві нестандартних лабораторій ПЛР.У процесі ПЛР, коли наконечник піпетки всмоктує та видуває рідину, а кришка пробірки ПЛР відкривається, утворюється аерозоль.Молекули ДНК, які переносить аерозоль (один аерозоль може нести десятки тисяч ДНК), важко усунути, оскільки вони плавають у повітрі.Як тільки буде введено наступний раунд ПЛР-експериментів, неминуче виникнуть помилкові позитивні результати.
Як показано на малюнку нижче, негативний контроль також посилив відповідну смугу інтересу:
Тут представлено першу частину цього випуску ПЛР-забруднення та запобігання.У наступному номері буде друга частина «Запобігання зараженню ПЛР-продукту», тому слідкуйте за новинами!
Час публікації: 25 липня 2017 р
