Пряма ПЛР – це реакція, яка безпосередньо використовує тканини тварин або рослин для ампліфікації без екстракції нуклеїнової кислоти.Багато в чому пряма ПЛР працює як звичайна ПЛР

Основною відмінністю є спеціальний буфер, який використовується в прямій ПЛР, зразок можна безпосередньо піддавати ПЛР-реакції без екстракції нуклеїнової кислоти, але існують відповідні вимоги до толерантності ферментів і сумісності буфера, який бере участь у прямій ПЛР-реакції.

Незважаючи на те, що в звичайних зразках є більша чи менша кількість інгібіторів ПЛР, пряма ПЛР все ще може досягти надійної ампліфікації під дією ферментів і буферів.Традиційна реакція ПЛР вимагає високоякісної нуклеїнової кислоти як матриці, яка може перешкоджати плавному перебігу реакції ПЛР, якщо матриця містить білки та інші домішки.Пряма ПЛР на даний момент є однією з найпопулярніших технологій у галузі молекулярної діагностики.

01 Пряма ПЛР спочатку використовувалася для тварин і рослин

Найбільш раннє застосування прямої ПЛР було в галузі тварин і рослин, таких як кров, тканини та шерсть щурів, кішок, курей, кроликів, овець, великої рогатої худоби тощо, листя та насіння рослин тощо, які використовуються для вивчення генотипу, трансгенності, виявлення плазмід, аналізу нокауту генів, ідентифікації джерела ДНК, ідентифікації видів, аналізу SNP та інших областях.

Ці поля мають деякі спільні риси, тобто вміст цільового гена є відносно високим, а виділення нуклеїнової кислоти складним, тому пряма ПЛР може не тільки заощадити час і мати незначний вплив на результати, але й заощадити кошти.

Пряма ПЛР, яка використовується для виявлення патогенів, є питанням останніх років, деякі виробники ПЛР-реагентів доклали багато зусиль у цьому напрямку, впроваджуючи інновації.Особливо під час цієї епідемії COVID-19 на ринку з’явилося багато таких продуктів для виявлення, як-от набір для виявлення нуклеїнових кислот SARS-CoV-2 (метод мультиплексного ПЛР з флуоресцентним зондом), досліджений і розроблений компанією Foregene, який використовує технологію RT-PCR у реальному часі (rRT-PCR) для якісного виявлення нуклеїнових кислот SARS-CoV-2 у носоглотці чи ротовій порожнині людини. зразки мазка з горловини.

Foregene є однією з компаній, що використовує технологію прямої ПЛР для виявлення нормальних ORF1ab, N, E таваріант лінії нуклеїнових кислот у зразках мазків з носоглотки або ротоглотки людини, такі як лінія SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), лінія B.1.351 (ZA), лінія B.1.617 (IND) і лінія P.1 (BR).

02  Реагенти, необхідні для прямої ПЛР

Зразок лізату

Зразок лізату можна налаштувати самостійно або придбати.Різниця в складі різних марок лізату зробить лізуючу здатність різною, і тоді час лізування буде дещо іншим.Наприклад, для підготовки зразків тканин тварин зазвичай рекомендується 30-хвилинний або нічний лізис, а лізисний розчин для вірусів коливається від 3-10 хвилин.

Основна суміш ПЛР

Рекомендується використовувати ДНК-полімеразу гарячого старту для посилення специфічної ампліфікації та збільшення здатності до ампліфікації.Основою прямої ПЛР є високотолерантна полімераза.

Усуньте або пригніть компоненти в зразку, які впливають на ампліфікацію ДНК

Після того, як зразок буде оброблено лізатом, білки, ліпіди та інші залишки клітин будуть вивільнені, ці речовини будуть пригнічувати реакцію ПЛР.Тому пряма ПЛР вимагає додавання відповідного видалення або інгібіторів, щоб зменшити вплив цих факторів.

03  Колекція з п'яти точок знань прямої ПЛР

По-перше, технологія Direct PCR – це технологія прямої ПЛР для різних біологічних зразків.За цієї технічної умови немає необхідності відокремлювати та екстрагувати нуклеїнову кислоту, безпосередньо використовувати зразок тканини як об’єкт і додавати праймери цільового гена для проведення реакції ПЛР.

По-друге, технологія прямої ПЛР – це не лише традиційна технологія ампліфікації шаблону ДНК, але також включає ПЛР зі зворотною транскрипцією на основі РНК.

По-третє, технологія Direct PCR не тільки безпосередньо виконує звичайні якісні ПЛР-реакції на зразках тканин, але також включає реакції qPCR у реальному часі, що вимагає, щоб реакційна система мала сильну здатність проти фонової флуоресцентної інтерференції та ендогенну флуоресценцію гасила антагоністичну здатність.

По-четверте, зразки, на які націлена технологія Direct PCR, потребують лише вивільнення матриць нуклеїнових кислот і не видаляють білки, полісахариди, іони солі тощо, які заважають реакції ПЛР.Це вимагає, щоб полімераза нуклеїнової кислоти та ПЛР-мікс у реакційній системі мали чудову стійкість і адаптивність для забезпечення активності ферменту та точності реплікації в складних умовах.

По-п’яте, зразок тканини, на який націлена технологія прямої ПЛР без будь-якої обробки збагачення нуклеїновими кислотами, і кількість матриці дуже мала, що вимагає від реакційної системи надзвичайно високої чутливості та ефективності ампліфікації.