Я вважаю, що кожен завжди стикається з тими чи іншими проблемами при проведенні ПЛР-реакцій, але більшість з них можна розділити на дві основні проблеми:

Занадто мала ампліфікація матриці гена (ампліфікація);
Забагато ампліфікації нецільового гена.
Використання добавок є однією із поширених стратегій вирішення цих проблем.Зазвичай роль добавок має два аспекти:
вторинна структурагенів (вторинна структура);
Зменшити неспецифічне праймування.
Сьогодні редактор коротко познайомить вас із поширеними добавками в реакціях ПЛР та їх функціями.
Добавки, що знижують вторинну структуру
сульфоксид(DMSO)
зразки генівз високим вмістом GC.Однак ДМСО також значно знижує активність полімерази Taq.Тому кожен повинен збалансувати доступність шаблону та активність полімерази.Редактор пропонує спробувати різні концентрації DSMO, наприклад від 2% до 10%, щоб знайти концентрацію, яка підходить для вашого експерименту.
Неіонні миючі засоби
Неіонні детергенти, такі як 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 або NP-40, зазвичай знижують вторинну структуру ДНК.Хоча це може збільшити ампліфікацію шаблонного гена, це також спричинить проблеми неспецифічної ампліфікації.Таким чином, ці добавки добре працюють для реакцій ПЛР з низьким виходом без уламків, але не дуже добре для реакцій з відносно нечистою ПЛР.Ще одна перевага неіоногенних миючих засобів — зменшення забруднення SDS.Зазвичай під час процесу екстракції ДНК SDS буде доведено до етапу ПЛР, що значно пригнічує активність полімерази.Тому додавання до реакції 0,5% Твін-20 або Твін-40 може нейтралізувати негативний вплив SDS.
Бетаїн_
Бетаїн може покращити ампліфікацію ДНК шляхом зменшення утворення вторинної структури і, як правило, є «таємничим» доповненням до комерційних наборів для ПЛР.Якщо ви хочете використовувати бетаїн, вам слід додати бетаїн або моногідрат бетаїну (Betaine або Betaine mono-hydrate), але не бетаїну гідрохлорид (Betaine HCl), довести до кінцевої концентрації 1-1,7 М.Бетаїн також може допомогти підвищити специфічність, оскільки він усуває залежність плавлення/денатурації ДНК від складу пари основ.
Добавки для зменшення неспецифічного праймінгу
Формамід
Формамід є загальновживаною органічною ПЛР добавкою.Він може поєднуватися з великою і малою борозенками в ДНК, тим самим знижуючи стабільність подвійної спіралі головної ДНК і знижуючи температуру плавлення ДНК.Концентрація формаміду, що використовується в експериментах ПЛР, зазвичай становить 1%-5%.
Тетраметиламоній хлорид( TMAC)
Хлорид тетраметиламонію може підвищувати специфічність гібридизації (специфічність гібридизації) і підвищувати температуру плавлення ДНК.Таким чином, TMAC може видалити неспецифічний праймінг і зменшити неправильне зв'язування ДНК і РНК.Якщо ви використовуєтевироджені праймерив реакції ПЛР не забудьте додати TMAC, який зазвичай використовується в концентрації 15-100 мМ.
Інші поширені добавки
На додаток до двох категорій добавок, згаданих вище, існує багато загальних добавок у реакціях ПЛР, хоча вони мають різні функції, але вони також дуже важливі.
Іон магнію
Іон магнію є незамінним кофактором (кофактором) полімерази, тобто без іона магнію полімераза неактивна.Однак занадто велика кількість іонів магнію також може вплинути на ефективність полімерази.Концентрація іонів магнію в кожній реакції ПЛР буде різною.Хелатоутворювачі (такі як EDTA або цитрат), концентрація dNTP і білків впливають на концентрацію іонів магнію.Отже, якщо у вас виникли проблеми з експериментом ПЛР, ви можете спробувати змінити різні концентрації іонів магнію, наприклад, від 1,0 до 4,0 мМ, з інтервалом 0,5–1 мМ між ними.
Варто зазначити, що кілька циклів заморожування-відтавання можуть призвести до концентраційного розшарування розчину хлориду магнію.Тому ви повинні повністю розчинити його перед кожним використанням і добре перемішати перед використанням.
Бичачий сироватковий альбумін(Бичачий альбумін, BSA)
В експериментах з молекулярної хімії бичачий сироватковий альбумін є дуже поширеною добавкою, особливо в експериментах з розщеплення рестриктазами та ПЛР.У реакціях ПЛР BSA допомагає зменшити забруднення, такі як фенольні сполуки.Також кажуть, що це може зменшити адгезію реагентів до стінки пробірки.У реакції ПЛР зазвичай концентрація доданого BSA може досягати 0,8 мг/мл.
 
Супутні товари:
Герой ПЛР(з барвником)
Герой ПЛР