Перевірка ефективності праймерів і зондів на ранній стадії ПЛР-реагентів і визначення найбільш прийнятних умов реакції є передумовами для забезпечення плавного проходження формальних експериментів.
Отже, як нам підтвердити праймер-зонд на ранній стадії?
Основними показниками є базова лінія, крива ампліфікації, значення ct, ефективність ампліфікації, виявлення зразка низької концентрації, CV тощо.
Базовий рівень
Базовою лінією є горизонтальна лінія на кривій ПЛР-ампліфікації.У перші кілька циклів реакції ампліфікації ПЛР сигнал флуоресценції не сильно змінюється і утворює пряму лінію.Ця пряма лінія є базовою.
Під час скринінгу ПЛР-праймерних зондів зверніть увагу на те, чи базова лінія знаходиться на рівні.Чистота концентрації праймерного зонда впливатиме на базову лінію, наприклад, спричиняючи підвищення або зниження базової лінії.Базова лінія також є дуже інтуїтивно зрозумілим показником.
Крива посилення
Іншим інтуїтивно зрозумілим показником є форма кривої підсилення.Найкраще мати S-подібну криву, щоб уникнути вторинного підсилення або інших ненормальних кривих підсилення.
Значення Ct
Кількість циклів, що відповідає точці перегину від базової лінії до експоненціального зростання, є значенням Ct.
Для одного зразка різні праймерні зонди призводять до різних кривих ампліфікації, і на відповідне значення Ct впливатимуть ефективність ампліфікації та ступінь інтерференції.Теоретично, чим менше значення Ct праймерного зонда, який ми обираємо, тим краще.
Ефективність посилення
Одним із найбільш надійних і стабільних методів оцінки ефективності ПЛР-ампліфікації є стандартна крива, яка також широко визнана дослідниками.Метод передбачає створення серії зразків для контролю відносної кількості цільових шаблонів.Ці зразки зазвичай виготовляють шляхом серійних розведень концентрованих вихідних розчинів, найчастіше використовують 10-кратне розведення.Використовуючи серію розведених зразків, використовуючи стандартну програму qPCR для ампліфікації, щоб отримати значення Cq, і, нарешті, накресліть стандартну криву відповідно до концентрації кожного зразка та відповідного значення Cq, щоб отримати лінійне рівняння Cq= -klgX0+b та ефективність ампліфікації E=10(-1 /k)-1.При використанні кПЦР для кількісного аналізу ефективність ампліфікації повинна бути в діапазоні 90%-110% (3,6>k>3,1).
Виявлення зразків низької концентрації
Коли концентрація зразка низька, швидкість виявлення різних праймерних зондів різна.Ми вибираємо 20 зразків із низькою концентрацією для реплікації, і система праймер-зонд із найвищим рівнем виявлення є найкращою.
Коефіцієнт варіації (CV)
10 дублікатів зразків можна виявити різними праймерними зондами відповідно до лінійного стандарту реагенту для виявлення ампліфікації нуклеїнової кислоти.
Кількісні реагенти:
Точність
Точність в межах однієї партії повинна відповідати: коефіцієнт варіації (CV,%) логарифмічного значення досліджуваної концентрації ≤5%.Коли концентрація зразка низька, коефіцієнт варіації (CV,%) логарифма концентрації виявлення становить ≤10%
Якісні реактиви:
Точність
Точність в одній партії повинна відповідати:
(1) Коефіцієнт варіації значення Ct (CV,%) ≤5%
Один і той же зразок тестують паралельно 10 разів, і результати тесту повинні бути послідовними
Час публікації: 18 вересня 2021 р
