Автори: Ван Сяоянь, Чжао Ерю

Підрозділ: лікарня Цзяочжоу, лікарня Дунфан при університеті Тунцзі

В даний час основним типом зразка для виявлення нуклеїнових кислот респіраторних збудників є мазок із горла.Існує багато видів розчинів для збереження зразків, які зазвичай використовуються, і всі вони потребують охолодження або заморожування для транспортування та зберігання;Важко контролювати весь процес низької температури під час процесу збору та транспортування, а також важко забезпечити контроль якості перед тестуванням зразка^[1-2].

РНКаза (РНКаза) — ендонуклеаза, яка гідролізує РНК, головним чином розриваючи фосфодіефірні зв’язки між нуклеотидами.Молекула РНКази дуже стабільна, в структурі є дисульфідні зв'язки, і для її активності не потрібна присутність двовалентних катіонів, тому РНКаза не легко денатурується, і її легко ренатурувати навіть після високої температури або використання денатуратів.РНКази поділяються на ендогенні та екзогенні.Ендогенні РНКази можуть вивільнятися одночасно з розривом клітин.Тому усунення ролі ендогенних РНКаз є дуже критичним кроком у процесі екстракції РНК.Екзогенні РНКази широко поширені.РНКази існують у повітрі, шкірі людини, волоссі та слині, що є важливою причиною легкої деградації РНК.^[3].

Запит даних

У технічних вимогах CANS-CL02-A009 «Застосування рекомендацій з акредитації якості та компетентності медичних лабораторій у галузі молекулярної діагностики» пропонується сформулювати відповідні стандарти якості води відповідно до заявки;Одноразові герметичні контейнери:

РНКаза/Класифікація

(1) РНКаза А

Рибонуклеаза А (РНКаза А), отримана з підшлункової залози великої рогатої худоби, є ендорибонуклеазою, яка може специфічно атакувати 3'-кінець залишків піримідину на РНК, розрізаючи цитозин або урацил, утворений сусідніми нуклеотидами.Фосфодіефірний зв’язок, кінцевим продуктом реакції є 3′ піримідиновий нуклеотид і олігонуклеотид з 3′ піримідиновим нуклеотидом на кінці.

(2) РНКаза T1

Рибонуклеаза Т1 (РНКаза Т1) походить від Aspergillus orjzae, вона специфічно діє на 3'-кінцевий фосфат гуаніну, а сайт розщеплення знаходиться між 3'-фосфатом гуаніну та 5'-гідроксилом сусідніх нуклеотидів.Кінцевим продуктом реакції є 3′гуанілова кислота та олігонуклеотидні фрагменти з 3′гуаніловою кислотою на кінці.

(3) РНКаза H

Рибонуклеазу Н (РНКазу Н) вперше виявили в тканині тимуса теляти, а її ген, що кодує, клонували в Escherichia coli.Він може специфічно розщеплювати ДНК: ланцюги РНК у гібридних дуплексах РНК, у результаті чого утворюються олігонуклеотиди та мононуклеотиди з 3′-ОН та 5′-монофосфатними кінцями, він не може розщеплювати одно- чи дволанцюгові ДНК або РНК.

РНКаза

Функція та використання

Рибонуклеаза може каталізувати розпад рибонуклеїнової кислоти (РНК) і може бути синтезована штучно.Лікарська мазь використовується місцево для лікування травм і болю в суглобах.Згідно з повідомленнями, рибонуклеаза може змінювати метаболізм клітин-господарів, пригнічувати синтез вірусу, пригнічувати проліферацію вірусу грипу in vitro та пригнічувати утворення коров’ячої віспи та вірусу герпесу в курячих ембріонах.Клінічне використання рибонуклеази щоденної внутрішньом’язової ін’єкції 180 мг, корисне для лікування епідемічного енцефаліту, рибонуклеаза може каталізувати деградацію рибонуклеїнової кислоти (РНК), і тепер її можна штучно синтезувати.Лікарська мазь використовується місцево для лікування травм і болю в суглобах.Згідно з повідомленнями, рибонуклеаза може змінювати метаболізм клітин-господарів, пригнічувати синтез вірусу, пригнічувати проліферацію вірусу грипу in vitro та пригнічувати утворення коров’ячої віспи та вірусу герпесу в курячих ембріонах.Клінічне застосування рибонуклеази щоденне внутрішньом’язове введення 180 мг є корисним для лікування епідемічного енцефаліту.

РНКаза

Визначення інгібітора

Визначення одиниці інгібітора РНКази: кількість ферменту, необхідного для інгібування 50% активності 5ng РНКази А, становить одну одиницю.

Як працюють інгібітори РНКази

Гуанідин ізотіоціанат:

Гуанідин ізотіоціанат — органічна сполука з молекулярною формулою C2H6N4S.В основному використовується в біологічній медицині, хімічних реагентах тощо. Гуанідин ізотіоціанат є агентом для лізування білка, і він часто використовується як основний компонент розчину для лізису в молекулярних діагностичних реагентах.Він може лізувати тканину, руйнувати клітинну структуру та відокремлювати нуклеїнову кислоту від нуклеопротеїну, а також має сильну денатурацію до РНКази.На даний момент це найефективніший інгібітор РНКази.

TRIzol - це новий реагент для екстракції загальної РНК, який може безпосередньо витягувати загальну РНК з клітин або тканин.Він містить такі речовини, як фенол і гуанідин ізотіоціанат, які можуть швидко руйнувати клітини та інгібувати нуклеази, що вивільняються клітинами.

(Проте гуанідин ізотіоціанат небезпечний для здоров'я лабораторних дослідників.)

Рназин:

Кислий глікопротеїн, витягнутий з печінки щура або бластодерми людини.Рназин є неконкурентним інгібітором РНКази, який може зв'язуватися з різними РНКазами, щоб інактивувати їх.

(Детальніше: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hвисока температура:

Висока температура також є поширеним засобом денатурації білка.

Діетилпірокарбонат (DEPC):

DEPC є сильним, але неповним інгібітором РНКази, який може пригнічувати активність РНКази шляхом поєднання з амінокислотним імідазольним кільцем активної групи РНКази для денатурації білків.

Ванадил рибонуклеозидний комплекс:

Комплекс, утворений іонами оксиду ванадію та нуклеозидами, який зв’язується з РНКазою у вигляді перехідних речовин, здатних майже повністю інгібувати активність РНКази.

інший:

Певну пригнічувальну дію на РНКазу мають також SDS, сечовина, діатомова земля тощо.

Відгуки експертів

Лі Юйцзе Головний технічний директор

Директор лабораторного відділу лікарні Цзяочжоу, лікарня Дунфан при університеті Тунцзі

Щоб запобігти біодеградації екзогенної РНКази, маски, рукавички та головні убори слід носити та часто замінювати під час процесу екстракції РНК.Весь скляний посуд необхідно випікати в сушильній шафі при 200°С більше 2 годин.Матеріали, які використовуються для випікання, наприклад пластик, потрібно обробити DEPC водою, а потім промити дистильованою водою.Реагенти або пристрої, що використовуються для екстракції, збереження та ідентифікації РНК, повинні бути призначені для РНК, і повинна бути створена незалежна зона роботи з РНК.

посилання:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Бактерії та віруси в носоглотці безпосередньо перед початком гострих інфекцій нижніх дихальних шляхів у корінних австралійських дітей [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018, 37 (9): 1785-1794.

[2] Відділення контролю за госпітальними інфекціями Китайської асоціації превентивної медицини.Рекомендації щодо збору та перевірки клінічних мікробних зразків [J].Китайський журнал лікарняної інфекції, 2018 (20): 3192-3200.

[3] «Клінічний тест Десять тисяч Чому Молекулярна біологія Тест Том»