• ПЛР - це метод, який використовується для ампліфікації ДНК з невеликої кількості матриці ДНК.RT-PCR використовує зворотну транскрипцію для отримання шаблону ДНК з джерела РНК, який потім можна ампліфікувати.
• ПЛР і RT-PCR зазвичай є реакціями кінцевої точки, тоді як qPCR і RT-qPCR використовують кінетику швидкості синтезу продукту під час реакції ПЛР для кількісного визначення кількості присутньої матриці.
• Новіші методи, такі як цифрова ПЛР, забезпечують абсолютну кількісну оцінку початкової матриці ДНК, тоді як такі методи, як ізотермічна ПЛР, зменшують потребу в дорогому обладнанні для отримання надійних результатів.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) є відносно простим і широко використовуваним методом молекулярної біології для ампліфікації та виявлення послідовностей ДНК і РНК.Порівняно з традиційними методами клонування та ампліфікації ДНК, які часто тривають днями, ПЛР вимагає лише кількох годин.ПЛР є високочутливим і вимагає мінімального шаблону для виявлення та ампліфікації специфічних послідовностей.Основні методи ПЛР просунулися від простого виявлення ДНК і РНК.Нижче ми надаємо огляд різних методів ПЛР і реагентів, які ми пропонуємо Enzo Life Sciences для ваших дослідницьких потреб.Ми прагнемо допомогти вченим швидко отримати доступ до ПЛР-реагентів для використання в наступному дослідницькому проекті!

ПЛР

Для стандартної ПЛР все, що вам потрібно, це ДНК-полімераза, магній, нуклеотиди, праймери, матриця ДНК, яку потрібно ампліфікувати, і термоциклер.Механізм ПЛР такий же простий, як і його мета: 1) дволанцюгова ДНК (dsDNA) денатурується нагріванням, 2) праймери вирівнюються до окремих ланцюгів ДНК і 3) праймери подовжуються ДНК-полімеразою, у результаті чого утворюються дві копії оригінальний ланцюг ДНК.Процес денатурації, відпалу та елонгації протягом низки температур і часу відомий як один цикл посилення (рис. 1).

Кожен крок циклу повинен бути оптимізований для використовуваного шаблону та набору праймерів.Цей цикл повторюється приблизно 20-40 разів, і потім ампліфікований продукт може бути проаналізований, як правило, за допомогою агарозного гелю (рис. 2).

Оскільки ПЛР є високочутливим методом і для однієї реакції потрібні дуже малі об’єми, рекомендується готувати майстер-мікс для кількох реакцій.Основну суміш необхідно добре перемішати, а потім розділити на кількість реакцій, переконавшись, що кожна реакція містить однакову кількість ферменту, dNTP і праймерів.Багато постачальників, наприклад Enzo Life Sciences, також пропонують суміші для ПЛР, які вже містять усе, крім праймерів і шаблону ДНК.

Ділянки, багаті гуаніном/цитозином (GC-багаті), представляють складну проблему в стандартних методах ПЛР.GC-збагачені послідовності більш стабільні, ніж послідовності з меншим вмістом GC.Крім того, послідовності, багаті на GC, мають тенденцію до утворення вторинних структур, таких як шпилькові петлі.Як наслідок, подвійні ланцюги, збагачені GC, важко повністю розділити під час фази денатурації.Отже, ДНК-полімераза не може безперешкодно синтезувати новий ланцюг.Вища температура денатурації може покращити це, а коригування в бік вищої температури відпалу та меншого часу відпалу може запобігти неспецифічному зв’язуванню праймерів, збагачених GC.Додаткові реагенти можуть посилити ампліфікацію GC-збагачених послідовностей.ДМСО, гліцерин і бетаїн допомагають порушити вторинні структури, викликані взаємодією GC, і таким чином полегшити розділення подвійних ланцюгів.

ПЛР з гарячим стартом

Неспецифічна ампліфікація є проблемою, яка може виникнути під час ПЛР.Більшість ДНК-полімераз, які використовуються для ПЛР, найкраще працюють при температурах приблизно від 68°C до 72°C.Однак фермент може бути активним і при нижчих температурах, хоча й меншою мірою.При температурах, значно нижчих за температуру відпалу, праймери можуть зв’язуватися неспецифічно та призводити до неспецифічної ампліфікації, навіть якщо реакція проводиться на льоду.Цьому можна запобігти, використовуючи інгібітори полімерази, які відокремлюються від ДНК-полімерази лише після досягнення певної температури, отже, термін ПЛР з гарячим стартом.Інгібітор може бути антитілом, яке зв'язує полімеразу та денатурує при початковій температурі денатурації (зазвичай 95°C).

Полімераза високої точності

Незважаючи на те, що ДНК-полімерази ампліфікуються досить точно до оригінальної послідовності матриці, можуть виникнути помилки у відповідності нуклеотидів.Невідповідності в програмах, таких як клонування, можуть призвести до скорочених транскриптів і неправильно трансльованих або неактивних білків.Щоб уникнути цих невідповідностей, полімерази з активністю «перечитування» були ідентифіковані та включені в робочий процес.Першу коректурну полімеразу, Pfu, було виявлено в 1991 році у Pyrococcus furiosus.Цей фермент Pfu має 3'-5' екзонуклеазну активність.Коли ДНК ампліфікується, екзонуклеаза видаляє невідповідні нуклеотиди на 3'-кінці ланцюга.Потім правильний нуклеотид замінюється, і синтез ДНК продовжується.Ідентифікація неправильних нуклеотидних послідовностей ґрунтується на спорідненості зв’язування правильного нуклеозидтрифосфату з ферментом, де неефективне зв’язування уповільнює синтез і дозволяє правильну заміну.Коректурна активність полімерази Pfu призводить до меншої кількості помилок у кінцевій послідовності порівняно з ДНК-полімеразою Taq.Останніми роками були виявлені інші ферменти коректури, а також були зроблені модифікації оригінального ферменту Pfu для подальшого зниження частоти помилок під час ампліфікації ДНК.

ОТ-ПЛР

ПЛР зі зворотною транскрипцією, або RT-PCR, дозволяє використовувати РНК як матрицю.Додатковий етап дозволяє виявити та ампліфікувати РНК.РНК зворотно транскрибується в комплементарну ДНК (кДНК) за допомогою зворотної транскриптази.Якість і чистота матриці РНК мають важливе значення для успіху RT-PCR.Першим кроком RT-PCR є синтез гібриду ДНК/РНК.Зворотна транскриптаза також має функцію РНКази Н, яка руйнує частину РНК гібрида.Потім одноланцюгова молекула ДНК завершується ДНК-залежною ДНК-полімеразною активністю зворотної транскриптази в кДНК.Ефективність реакції першого ланцюга може впливати на процес ампліфікації.З цього моменту для ампліфікації кДНК використовується стандартна процедура ПЛР.Можливість перетворити РНК на кДНК за допомогою RT-PCR має багато переваг, і вона в основному використовується для аналізу експресії генів.РНК одноланцюгова і дуже нестабільна, що ускладнює роботу з нею.Це зазвичай служить першим кроком у кПЦР, яка кількісно визначає транскрипти РНК у біологічному зразку.

КПЦР та ЗТ-кПЛР

Кількісна ПЛР (qPCR) використовується для виявлення, характеристики та кількісного визначення нуклеїнових кислот для багатьох застосувань.У RT-qPCR транскрипти РНК часто кількісно визначають шляхом зворотної транскрипції їх у кДНК спочатку, як описано вище, а потім згодом проводять qPCR.Як і в стандартній ПЛР, ДНК ампліфікується за допомогою трьох повторюваних етапів: денатурації, відпалу та елонгації.Однак у qPCR флуоресцентне мічення дає змогу збирати дані під час ПЛР.Ця техніка має багато переваг завдяки різноманітності доступних методів і хімікатів.

У кПЦР на основі барвника (зазвичай зеленого) флуоресцентне мічення дозволяє кількісно визначити ампліфіковані молекули ДНК за допомогою барвника, що зв’язує дцДНК.Протягом кожного циклу вимірюється флуоресценція.Сигнал флуоресценції зростає пропорційно кількості реплікованої ДНК.Таким чином, ДНК кількісно визначається в «реальному часі» (рис. 3).Недоліки кПЦР на основі барвника полягають у тому, що одночасно можна досліджувати лише одну мішень і що барвник зв’язується з будь-якою ds-ДНК, присутньою у зразку.

У кПЦР на основі зонда багато мішеней можна виявити одночасно в кожному зразку, але це вимагає оптимізації та розробки спеціального зонда(ів), що використовується на додаток до праймерів.Доступно декілька типів конструкцій зондів, але найпоширенішим типом є гідролізний зонд, який містить флуорофор і гасник.Передача енергії флуоресцентного резонансу (FRET) запобігає випромінюванню флуорофора через гасник, поки зонд неушкоджений.Однак під час реакції ПЛР зонд гідролізується під час подовження праймера та ампліфікації специфічної послідовності, з якою він зв’язаний.Розщеплення зонда відокремлює флуорофор від гасника і призводить до залежного від ампліфікації збільшення флуоресценції (рис. 4).Таким чином, сигнал флуоресценції від реакції КПЦР на основі зонда пропорційний кількості цільової послідовності зонда, присутньої в зразку.Оскільки кПЦР на основі зонда є більш специфічною, ніж кПЦР на основі барвника, її часто використовують у діагностичних аналізах на основі кПЦР.

Ізотермічне посилення

Згадані вище методи ПЛР вимагають дорогого термоциклічного обладнання для точного підвищення та зниження температури камери для етапів денатурації, відпалу та подовження.Було розроблено низку методик, які не потребують таких точних пристроїв і можуть виконуватися на простій водяній бані або навіть у клітинах, що цікавлять.Ці методи разом називаються ізотермічним посиленням і працюють на основі експоненціального, лінійного або каскадного посилення.

Найвідомішим типом ізотермічного підсилення є ізотермічна ампліфікація, опосередкована петлею, або LAMP.LAMP використовує експоненціальну ампліфікацію при 65⁰C для ампліфікації матричної ДНК або РНК.Під час виконання LAMP чотири-шість праймерів, комплементарних ділянкам цільової ДНК, використовуються з ДНК-полімеразою для синтезу нової ДНК.Два з цих праймерів мають компліментарні послідовності, які розпізнають послідовності в інших праймерах і зв’язують їх, дозволяючи утворити «петлеву» структуру в новосинтезованій ДНК, яка потім сприяє відпалу праймерів у наступних раундах ампліфікації.LAMP можна візуалізувати кількома методами, включаючи флуоресценцію, електрофорез у агарозному гелі або колориметрію.Легкість візуалізації та виявлення присутності або відсутності продукту за допомогою колориметрії та відсутність необхідного дорогого обладнання зробили LAMP придатним варіантом для тестування на SARS-CoV-2 у регіонах, де клінічні лабораторні тести були недоступні, або для зберігання та транспортування зразків. було неможливо, або в лабораторіях, які раніше не мали термоциклічного обладнання ПЛР.