• facebook
  • Linkedin
  • youtube

Кілька революційних винаходів в історії технології виявлення, на мій погляд, це технологія імуномаркування, заснована на принципі специфічного зв’язування антигену з антитілом, технологія ПЛР і технологія секвенування.Сьогодні мова піде про технологію ПЛР.Відповідно до еволюції технології ПЛР люди зазвичай ділять технологію ПЛР на три покоління: звичайна технологія ПЛР, технологія флуоресцентної кількісної ПЛР у реальному часі та технологія цифрової ПЛР.

Cпоширена методика ПЛР

w1

КЕРІ МАЛЛІС (1944.12.28-2019.8.7)

Кері Малліс винайшов полімеразну ланцюгову реакцію (полімеразну ланцюгову реакцію, ПЛР) у 1983 році. Кажуть, коли він їхав за кермом своєї дівчини, у нього раптом спалахнуло натхнення, і він подумав про принцип ПЛР (про користь водіння).Кері Мулліс був удостоєний Нобелівської премії з хімії в 1993 році. The New York Times прокоментувала: «Надзвичайно оригінальний і значний, майже розділяючи біологію на періоди до ПЛР і після ПЛР.

Принцип ПЛР: під час каталізу ДНК-полімерази материнська ланцюг ДНК використовується як матриця, а специфічний праймер використовується як початкова точка подовження, а дочірня ланцюг ДНК, комплементарна матричній ДНК матриці, копіюється in vitro шляхом денатурації, відпалу, подовження та інших етапів.Це технологія ампліфікації синтезу ДНК in vitro, яка може швидко та специфічно ампліфікувати будь-яку цільову ДНК in vitro.

w2

Переваги звичайної ПЛР
1.Класичний метод, повні міжнародні та вітчизняні стандарти
2.Менша вартість реагентів для приладів
3.Продукти ПЛР можна відновити для інших експериментів молекулярної біології
Рекомендований ПЛР-апарат Foregene: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Пов’язані продукти: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Недоліки звичайної ПЛР
1.легко забруднити
2.громіздка операція
3.тільки якісний аналіз
4.Помірна чутливість
5.Існує неспецифічна ампліфікація, і коли неспецифічна смуга такого ж розміру, як цільова смуга, її неможливо розрізнити
 
Cапілярний електрофорез на основі ПЛР
У відповідь на недоліки звичайної ПЛР деякі виробники представили прилади, засновані на принципі капілярного електрофорезу.Етап електрофорезу після ПЛР-ампліфікації завершується в капілярі.Чутливість вища, і різницю в кількох основах можна розрізнити, а посилення можна розрахувати MAERKER.вміст продукту.Недоліком є ​​те, що ПЛР-продукт все одно потрібно відкрити та помістити в інструмент, і все ще існує великий ризик зараження.

w3

CапілярнийEелектрофорез

 

2. Технологія флуоресцентної кількісної ПЛР у реальному часі (Quantitative Real-time PCR, qPCR)Флуоресцентна кількісна ПЛР, яку також називають ПЛР у реальному часі, — це нова технологія кількісного визначення нуклеїнових кислот, розроблена PE (Perkin Elmer) у 1995 році. Історія розвитку флуоресцентної кількісної ПЛР — це історія хвилюючої боротьби таких гігантів, як ABI, Roche та Bio-Rad.Якщо вам цікаво, ви можете перевірити це.Цей метод на даний момент є найбільш зрілим і широко використовуваним методом напівкількісної ПЛР.

Рекомендований апарат qPCR: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/

Метод флуоресцентного барвника (SYBR Green I):SYBR Green I — це найпоширеніший ДНК-зв’язуючий барвник для кількісної ПЛР, який неспецифічно зв’язується з дволанцюговою ДНК.У вільному стані SYBR Green випромінює слабку флуоресценцію, але після зв’язування з дволанцюговою ДНК його флуоресценція збільшується в 1000 разів.Таким чином, загальний флуоресцентний сигнал, випромінюваний реакцією, пропорційний кількості присутньої дволанцюгової ДНК і зростатиме зі збільшенням ампліфікованого продукту.Оскільки барвник неспецифічно зв’язується з дволанцюговою ДНК, можуть бути отримані хибнопозитивні результати.

Пов’язані продукти: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/

Метод флуоресцентного зонда (технологія Taqman): ПротягомПЛР-ампліфікація, специфічний флуоресцентний зонд додається одночасно з парою праймерів.Зонд є лінійним олігонуклеотидом з флуоресцентною репортерною групою та групою флуоресцентного гасника, відповідно, позначеними на обох кінцях.Коли зонд неушкоджений, флуоресцентний сигнал, випромінюваний репортерною групою, поглинається групою гасника, і виявлення. Флуоресцентний сигнал відсутній;під час ПЛР-ампліфікації (на стадії подовження) активність 5'-3' Dicer ферменту Taq буде перетравлювати та деградувати зонд, таким чином репортерна флуоресцентна група та гасительна флуоресцентна група розділені, так що система моніторингу флуоресценції може отримати флуоресцентний сигнал, тобто кожного разу, коли ланцюг ДНК ампліфікується, утворюється флуоресцентна молекула, яка реалізує повну синхронізацію накопичення флуоресцентних сигналів і утворення продуктів ПЛР.Метод зонда Taqman є найбільш часто використовуваним методом виявлення в клінічній діагностиці.

Пов’язані продукти: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/

w4

Переваги КПЦР
1.Метод зрілий, допоміжне обладнання та реагенти готові
2.Середня вартість реагентів
3.простий у використанні
4.Висока чутливість і специфічність виявлення
 
Недоліки КПЦР

Мутація цільового гена призводить до пропуску виявлення.
Неможливо визначити результат виявлення шаблону низької концентрації.
Існує велика похибка при використанні стандартної кривої для кількісного визначення.
 
3. Цифрова ПЛР (digital PCR, dPCR) технологія
Цифрова ПЛР – це техніка для абсолютного кількісного визначення молекул нуклеїнових кислот.У порівнянні з КПЦР цифрова ПЛР може безпосередньо зчитувати кількість молекул ДНК/РНК, що є абсолютним кількісним визначенням молекул нуклеїнової кислоти у вихідному зразку.У 1999 році Берт Фогельштейн і Кеннет В. Кін-злер офіційно запропонували концепцію dPCR.
 
У 2006 році компанія Fluidigm першою випустила комерційний прилад dPCR на основі чіпа.У 2009 році Life Technologies випустила системи OpenArray і QuantStudio 12K Flex dPCR.У 2013 році Life Technologies запустила систему QuantStudio 3DdPCR, яка використовує технологію нанорозмірних мікрофлюїдних чіпів високої щільності для рівномірного розподілу зразків по 20 000 окремих клітин.в реакційній свердловині.

w5

У 2011 році Bio-Rad випустила краплинний прилад QX100 dPCR, який використовує технологію вода в маслі для рівномірного розподілу зразка на 20 000 крапель води в маслі та використовує аналізатор крапель для аналізу крапель.У 2012 році компанія RainDance запустила прилад RainDrop dPCR, що працює за допомогою газу під високим тиском, щоб розділити кожну стандартну реакційну систему на реакційну емульсію, що містить від 1 мільйона до 10 мільйонів піколітрових мікрокрапель.

w6

На сьогоднішній день цифрова ПЛР сформувала дві основні фракції: тип чіпа та тип краплі.Незалежно від типу цифрової ПЛР, її основними принципами є обмеження розведення, кінцева ПЛР і розподіл Пуассона.Стандартна реакційна система ПЛР, що містить матриці нуклеїнових кислот, рівномірно розділена на десятки тисяч ПЛР-реакцій, які розподіляються по чіпах або мікрокраплях, так що кожна реакція містить якомога більше молекули-матриці, і виконується реакція ПЛР-матриці з однією молекулою.За допомогою зчитування флуоресценції підраховується наявність або відсутність сигналу, а абсолютна кількісна оцінка виконується після калібрування статистичного розподілу Пуассона.

Нижче наведено характеристики кількох цифрових ПЛР-платформ, які я використовував:

1. Краплинний цифровий ПЛР Bio-Rad QX200 Bio-RadQX200 — це дуже класична цифрова платформа ПЛР, основний процес виявлення: 20 000 зразків генеруються генератором крапель. Мікрокраплі води в маслі ампліфікуються на звичайній машині ПЛР, і, нарешті, сигнал флуоресценції кожної мікрокраплі зчитується пристроєм для зчитування мікрокрапель.Операція більш складна, а ризик забруднення середній.

w7

Цифрова мікрокрапельна ПЛР Xinyi TD1Xinyi TD1 — це домашня цифрова платформа ПЛР, основний процес виявлення: генерація 30 000-50 000 крапель води в маслі за допомогою генератора крапель, ампліфікація на загальному приладі ПЛР і, нарешті, пропускання. Зчитувач крапель зчитує флуоресцентний сигнал кожної краплі.Генерація крапель і зчитування на цій платформі виконуються в спеціальному чіпі з низьким ризиком забруднення.

w8

 Цифрова ПЛР з мікрокраплинним чіпом STILLA NaicaSTILLA Naica – відносно нова цифрова платформа ПЛР.Основний процес виявлення такий: додайте реакційний розчин до чіпа, помістіть чіп у систему генерації та ампліфікації мікрокрапель і згенеруйте 30 000 мікрокрапель.Нанесіть на чіп, і ПЛР-ампліфікація завершиться на чіпі.Потім посилений чіп передається в систему аналізу зчитування мікрокрапель, і флуоресцентний сигнал зчитується шляхом фотографування.Оскільки весь процес відбувається в закритому чіпі, ризик забруднення низький.

w9

4. ThermoFisher QuantStudio 3D чіп цифровий ПЛР

ThermoFisher QuantStudio 3D — ще одна класична цифрова платформа ПЛР на основі чіпа.Його основний процес виявлення такий: додайте реакційний розчин у розповсюджувач і рівномірно розподіліть реакційний розчин на чіпі з 20 000 мікролунками через розповсюджувач., помістіть чіп на ПЛР-машину для посилення, і, нарешті, вставте чіп у зчитувач і сфотографуйте, щоб прочитати флуоресцентний сигнал.Операція відносно складна, і весь процес здійснюється в закритому чіпі, і ризик забруднення низький.

w10

5. JN MEDSYS Clarity chip digital PCR

JN MEDSYS Clarity — це відносно нова цифрова платформа ПЛР на основі чіпа.Його основний процес виявлення такий: додайте реакційний розчин в аплікатор і рівномірно розподіліть реакційний розчин на 10 000 пробірок для ПЛР, закріплених у пробірці для ПЛР, через аплікатор.На мікропористому чіпі реакційний розчин потрапляє в чіп за допомогою капілярної дії, і ПЛР-пробірку з чіпом поміщають на ПЛР-машину для ампліфікації, і, нарешті, чіп поміщають у зчитувач для зчитування флуоресцентного сигналу шляхом фотографування.Операція більш складна.Ризик зараження низький.

w11

Параметри кожної цифрової ПЛР-платформи підсумовуються таким чином:

w12

Показниками оцінки цифрової ПЛР-платформи є: кількість розділених одиниць, кількість флуоресцентних каналів, складність роботи та ризик зараження.Але найголовніше – це точність виявлення.Один із способів оцінити цифрові ПЛР-платформи — використовувати кілька цифрових ПЛР-платформ для перевірки одна одної, а інший — використовувати стандартні речовини з точними значеннями.

Переваги dPCR
1.Досягнення абсолютної кількісної оцінки
2.Вища чутливість і специфічність
3.Може виявити низькі зразки копій
Недоліки dPCR1. Дороге обладнання та реагенти 2. Складна робота та тривалий час виявлення 3. Вузький діапазон виявлення

Наразі три покоління технології ПЛР мають свої переваги та недоліки, і кожне має власні сфери застосування, і це не зв’язок, що одне покоління замінює інше.Постійний розвиток технологій додав нову життєву силу технології ПЛР, дозволяючи їй відкривати один напрямок застосування за іншим, роблячи виявлення нуклеїнових кислот більш зручним і точним.
Джерело: Доктор Юань бере вас на тестування
 
Рекомендовані продукти:


Час публікації: 18 листопада 2022 р