1. Визначте абсорбцію розчину РНК
Поглинання при 280, 320, 230 і 260 нм представляє значення нуклеїнової кислоти, фону (каламутність розчину), концентрації солі та органічної речовини, наприклад білка, відповідно.Зазвичай дивіться лише на OD260/OD280 (Співвідношення, R).Коли 1,8~2,0, ми вважаємо, що забруднення білка або інших органічних речовин у РНК допустимо, але слід зазначити, що коли Тріс використовується як буфер для виявлення поглинання, значення R може бути більше 2 (зазвичай воно має бути <2,2).Коли R<1,8, забруднення білка або інших органічних речовин у розчині є більш очевидним, і долю РНК можна визначити відповідно до потреб.Коли R>2,2, це означає, що РНК була гідролізована в одну нуклеїнову кислоту.
2. Електрофорез РНК
Як правило, для електрофорезу РНК використовується денатуруючий гель, але якщо це лише для визначення якості РНК, денатуруючий гель не потрібен, можна використовувати звичайний агарозний гель.Метою електрофорезу є виявлення цілісності смуг 28S і 18S та їх співвідношення, або цілісності мазка мРНК.Як правило, якщо смуги 28S і 18S яскраві, чіткі та чіткі (краї смуг чіткі), а яскравість 28S більш ніж удвічі перевищує яскравість смуги 18S, ми вважаємо якість РНК хорошою.
Вище наведено два методи, які ми зазвичай використовуємо, але жоден із цих двох методів не може чітко сказати нам, чи є залишкова РНКаза в розчині РНК.Якщо в розчині є дуже мала кількість РНКази, нам важко виявити її за допомогою вищевказаного методу, але більшість наступних ферментативних реакцій проводяться при температурі вище 37 градусів і протягом тривалого часу.Таким чином, якщо в розчині РНК є дуже невелика кількість РНКази, тоді буде дуже придатне середовище та час, щоб зіграти свою роль у наступних експериментах, і, звичайно, в цей час експеримент буде холодним.Нижче ми представляємо метод, який може підтвердити наявність залишкової РНКази в розчині РНК.
3. Тест на збереження тепла
Відповідно до концентрації зразка, візьміть два 1000 нг РНК із розчину РНК і додайте його в центрифужну пробірку на 0,5 мл, додайте трис-буфер pH 7,0 до загального об’єму 10 мкл, а потім закрийте кришку пробірки.Одну з них помістіть на водяну баню постійної температури 70 °C і тримайте в теплі протягом 1 години.Іншу частину зберігали в холодильнику при -20°С протягом 1 год.Коли час закінчиться, вийміть два зразки для електрофорезу.Після завершення електрофорезу порівняйте електрофоретичні смуги обох.Якщо смуги обох є узгодженими або не мають істотної різниці (звичайно, їхні смуги також відповідають умовам методу 2), це означає, що в розчині РНК немає залишкового забруднення РНКази, а якість РНК дуже добра.Навпаки, якщо зразок, інкубований при 70°C, демонструє очевидне розкладання, це вказує на забруднення РНКазою в розчині РНК.
2 Експериментальні методи та методика виділення РНК
Проблеми, з якими ми часто стикаємось під час екстракції РНК: (1) низький вихід РНК;(2) РНК має серйозне забруднення сіллю;(3) РНК має серйозне забруднення органічними розчинниками;(4) деградація зразка та інші проблеми
1. Зазвичай використовувані реагенти для екстракції загальної РНК
Метод ізотіоціанату гуанідину та метод Тризолу є найбільш часто використовуваними методами екстракції сумарної РНК із тканин і клітин тварин.Це особливо підходить для невеликих зразків і тканин, які особливо важко екстрагувати, таких як екстракція загальної РНК із шкіри кролика та сполучної тканини тварин;крім того, Тризол, як реагент для лізису загального призначення, також можна використовувати для екстракції рослинних тканин, бактерій, грибків та інших тканин.Для рослинних тканин, що містять полісахариди та поліфеноли, таких як камелія масляна, листя чаю, насіння ріпаку тощо, метод CTAB також можна використовувати для екстракції загальної РНК.
Будучи звичайним методом, метод подвійної колонки також дуже популярний завдяки нормальному температурному режиму, відсутності необхідності додавання РНКази та безпечності — відсутність хлороформу, фенолів та інших органічних реагентів для екстракції.(рекомендовані продукти )
2. Виділення тотальної РНК із тканин тварин
(1) Спробуйте вибрати свіжу серветку, якщо вона не свіжа (бажано протягом трьох місяців — у холодильнику при 80 ℃ або заморожену в рідкому азоті. Розрізаючи тканину, не розрізайте її безпосередньо при кімнатній температурі, обов’язково покладіть її в ящик для льоду, намагайтеся уникати повторного заморожування та розморожування.
(2) Використовуйте чисті ножиці та пінцет, щоб відрізати невеликий шматочок тканини, спробуйте вирізати центральну частину тканини під час розрізання зразка або спочатку відріжте великий шматок тканини від середини, а потім виріжте зразок у місці свіжого розрізу.Видалену тканину слід повністю подрібнити, помістити подрібнену тканину в пробірку EP без РНКази, додати лізат, подрібнену тканину слід повністю піддати впливу лізату та підготувати до гомогенізації.
(3) Для нормальних тканин виберіть для гомогенізації тканини розміром з квасолю мунг (30-60 мг).Якщо тканини містять велику кількість білка, жиру або щільних волокнистих тканин, таких як печінка, належним чином збільште або зменшіть кількість вирізаних тканин (необов’язково). Виберіть 10~20 мг).
(4) Якщо екстрагуються м’язи риби, м’ясо креветок, медузи та інші тканини з високим вмістом води, об’єм зразка слід відповідно збільшити (рекомендовано 100-200 мг).
(5) Якщо умови дозволяють, тваринну тканину можна безпосередньо екстрагувати після гомогенізації за допомогою гомогенізатора тканини з високою пропускною здатністю, якщо такого обладнання немає.
(6) РНК, отриману після остаточної екстракції, необхідно негайно помістити в контейнер для льоду, щоб зменшити деградацію РНК.
3. Екстракція РНК тваринної клітини
(1) Суспензія клітин: відцентрифугуйте безпосередньо та викиньте середовище, промийте стерильним PBS 1-2 рази, потім суспендуйте у відповідній кількості PBS, а потім додайте лізат для лізису.Не додавайте лізат безпосередньо до осаджених клітин після повного видалення рідини.Це призведе до того, що гістоновий пакет, який вивільниться після лізованих клітин на зовнішньому шарі, прилипне до зовнішньої частини осаджених клітин, тим самим обмежуючи контакт клітин усередині гранули з лізатом., що призводить до неповного лізису клітин і зниження виходу РНК.
(2) Клітини, які є напівприклеєними або нещільно прилеглими: після викидання середовища промийте PBS 1-2 рази, потім безпосередньо поглиніть відповідну кількість PBS і продуйте чашку з культурою піпеткою або пістолетом, щоб здути клітини та перенести їх у клітини, вільні від РНК.Додайте лізат у пробірку ЕР з ферментом для екстракції.
(3) Прикріплені клітини: спочатку потрібно розщепити трипсином, потім зібрати в EP-пробірки без РНКази, центрифугувати для видалення супернатанту, промити 1-2 рази PBS для видалення надлишку трипсину та ресуспендувати у відповідній кількості PBS. Потім перейти до етапу екстракції.
4. Екстракція рослинної РНК
Рослинні тканини багаті фенольними сполуками, або багаті полісахаридами, або містять деякі неідентифіковані вторинні метаболіти, або мають високу активність РНКази.Ці речовини щільно з'єднуються з РНК після лізису клітин, утворюючи нерозчинні комплекси або колоїдні преципітати, які важко видалити.Тому, коли ми витягуємо рослинну тканину, нам потрібно вибрати набір для рослин.Лізат в наборі може ефективно вирішувати проблеми легкого окислення поліфенолів і розділення полісахаридних сполук і нуклеїнових кислот.
(Для екстракції рослинної РНК полісахаридних поліфенолів рекомендовані продукти:
(1) Шкірку, м’якоть, насіння, листя тощо рослини слід повністю подрібнити в ступці.Під час процесу подрібнення рідкий азот слід вчасно поповнювати, щоб уникнути розплавлення зразка.Подрібнений зразок слід швидко додати до лізату та струсити, щоб уникнути деградації РНК.
(2) Для зразків, багатих на клітковину, таких як листя рису та пшениці, кількість екстракції має бути належним чином зменшена, інакше подрібнення та лізис тканини не будуть завершені, що призведе до низького виходу екстрагованої РНК.
(3) Для рослинних тканин із високим вмістом води, таких як плоди гранату, плоди кавуна, плоди персика тощо, розмір зразка слід відповідно збільшити (100-200 мг необов’язково).
(4) Для рослинних тканин, таких як листя рослин, кореневища, тверді плоди та інші матеріали, як правило, рекомендується використовувати рідкий азот для ретельного розтирання інгредієнтів у ступці, а потім переходити до етапу екстракції.Звичайні гомогенізатори тканин можуть бути неефективними для гомогенізації рослинних тканин, тому їх, як правило, не рекомендують.
5. Запобіжні заходи при екстракції РНК
(1) Зразки тканин повинні бути максимально свіжими, щоб уникнути повторного заморожування та розморожування.
(2) Тканина повинна бути повністю подрібнена під час екстракції, і кількість тканини не повинна бути занадто малою, не кажучи вже про занадто багато.
(3) Після додавання лізату необхідно дати достатній час інкубації для повного лізування зразка.
(4) При використанні методу Trizol для екстракції принцип поглинання надосадової рідини після стратифікації такий: «краще вдихати менше, ніж вдихати більше», і не слід екстрагувати до середнього шару, інакше це спричинить серйозне забруднення геномної ДНК.
(5) Під час промивання промивна рідина повинна повністю просочитися навколо стінки трубки, щоб забезпечити ретельне промивання.
(6) Для методу екстракції колонки, крім від’єднання колонки після промивання, адсорбційну колонку слід також помістити в ультрачистий стенд і продувати протягом 5-10 хвилин, щоб повністю випарувати органічний розчинник досуха.
(7) Під час останнього елюювання методом колонки, після додавання води DEPC, її слід інкубувати протягом 3-5 хвилин, або воду DEPC слід заздалегідь нагріти до 60°C, щоб збільшити вихід елюції.У традиційному методі розщеплення Тризолом і осадження ізопропанолом кінцева РНК розчиняється у воді DEPC, тому для розчинення слід дати відповідний час, а дно центрифужної пробірки слід безперервно продувати наконечником піпетки.
3 Тhree Причини та рішення для низької концентрації РНК/поганої якості
1. Урожайність надто низька
Екстрагованого зразка занадто мало, загальна кількість недостатня, або екстрагованого зразка занадто багато, і лізис не завершено;для екстракції слід використовувати тканину або клітини відповідної якості, попередню обробку зразка слід добре провести, а лізис має бути достатнім.
2. Залишки геному
Під час екстракції методом Тризол, коли супернатант всмоктується в середній шар після нашарування, буде спричинено серйозне забруднення геному;слід бути особливо обережним при укладанні шарів, щоб уникнути всмоктування в середній шар.Якщо для екстракції використовується колонковий метод, для екстракції можна вибрати набір, що містить ДНКазу I.Нуклеїнова кислота, адсорбована на мембрані, безпосередньо розщеплюється ДНКазою I, що може значно зменшити кількість залишків ДНК.
3. Деградація РНК
Це може бути деградація самого екстрагованого зразка або деградація, викликана під час процесу екстракції;наскільки це можливо, свіжі зразки слід використовувати для екстракції РНК, а зібрані зразки слід зберігати в рідкому азоті або в холодильнику -80 °C, і слід уникати повторного заморожування та розморожування.У процесі екстракції РНК слід використовувати наконечники без РНКази/ДНКази, центрифужні пробірки та інші матеріали.Процес екстракції повинен бути максимально швидким.Екстраговану РНК слід помістити в коробку з льодом і зберігати при температурі -80.Якщо вилучену РНК необхідно виявити за допомогою електрофорезу в гелі, електрофорез необхідно провести відразу після екстракції, а буфер для електрофорезу слід замінити новоприготованим.
4. Залишки солі та органічних розчинників
Екстракційні реагенти містять фенол і солі гуанідину, а промивний розчин містить етанол.Під час процесу екстракції лізат не був повністю поглинений і викинутий, а промивний розчин не був повністю висушений.Залишки солей і органічних розчинників шкідливі для подальшої зворотної транскрипції та ПЛР.Різні ступені інгібування, тому лізат тканини має бути повністю видалений під час процесу екстракції, а промивання має бути достатнім, щоб можна було промити навколишні стінки трубки.Крім того, необхідним етапом є спорожнення труби та продувка, яка ще більше зменшить залишок органічних речовин.
Для отримання додаткової інформації про виділення РНК, будь ласка, перейдіть на наш веб-сайт:
www.foreivd.com для отримання додаткової інформації.
Час публікації: 01 грудня 2022 р
